Oamenii de știință dezvoltă hidrogeluri ADN inovatoare pentru eliberarea susținută a medicamentelor

Într-un studiu publicat recent de o echipă de cercetători de la Tokyo University of Science, a fost dezvoltat un hidrogel pe bază de ADN cu structură Takumi minimalizată, menit să ofere reținere prelungită în organism după administrare in vivo. Această abordare își propune să îmbunătățească eficiența și stabilitatea livrării de substanțe bioactive, inclusiv medicamente sau antigene.
În japoneză, Takumi înseamnă artizan sau priceput, reprezentând moștenirea măiestriei și excelenței.

Hidrogelurile sunt materiale polimerice bogate în apă, cu proprietăți tridimensionale care permit eliberarea susținută a medicamentelor. De-a lungul timpului, s-au dezvoltat numeroase tipuri de hidrogeluri, fie pe bază de polimeri naturali (de exemplu, chitosan), fie sintetici (de exemplu, polietilen glicol). ADN-ul ca material pentru hidrogel prezintă avantaje specifice: secvența sa poate fi programată pentru a forma structuri complexe, iar recent, tehnologiile de ADN nanotehnologic au dus la obținerea unor structuri inovatoare. Un exemplu anterior sunt acizii nucleici nanostructurați asemănători polipodului (cu trei sau mai multe „brațe”) și hidrogelurile obținute fără ajutorul ADN ligazei. Totuși, hidrogelurile ADN anterioare necesitau designul multor oligonucleotide (ODN) și aveau costuri mari de producție. În acest context, noul design „Takumi” reduce semnificativ numărul de oligonucleotide necesare și lungimea lor, urmărind totodată menținerea unei rețineri prelungite după administrarea în organism.

Metodologie și proiectare

• Oligonucleotidele (ODN): Cercetătorii au ales două ODN-uri complementare, fiecare proiectat să formeze o structură “Takumi-shaped unit” prin auto-dimerizare (tulpină palindromică) și să prezinte părți coezive la capete.  
• Concentrația finală de ADN: Pentru formarea hidrogelului, soluțiile de ODN s-au concentrat până la 11–44 mg/mL, în prezența a 150 mM NaCl.  
• Formarea unităților Takumi: S-a încălzit fiecare ODN la 95 °C timp de 5 minute și s-a răcit treptat la 4 °C. Ulterior, cele două tipuri de unități (numite unit1 și unit2) au fost amestecate, obținându-se hidrogelul final.  
• Analize de laborator:

• Electroforeză în gel de poliacrilamidă (PAGE): pentru a verifica formarea unităților și a hidrogelului (migrări distincte ale benzilor).  
• Temperatura de topire (Tm): măsurată prin creșterea treptată a temperaturii de la 20 °C la 95 °C și monitorizarea absorbției la 260 nm.  
• Reologie (modul de stocare G′ și modul de pierdere G″): pentru a evalua comportamentul sol-gel în funcție de temperatură și de tăria hidrogelului.  

Participanți și protocol animal

• S-au folosit șoareci ddY, masculi, cu vârsta de 6 săptămâni, menținuți în regim SPF (fără patogeni specifici).  
• Administrarea subcutanată și intratumorală:  

• Pentru studii de retenție, hidrogelul marcat cu propidiu iodid (PI) a fost injectat subcutanat la doza de 1,32 mg ADN/șoarece.  
• Pentru studii cu doxorubicină (DOX), s-a injectat doxorubicină liberă sau încapsulată în hidrogel la doza de 40 μg DOX/mouse, respectiv 100 μg ADN/mouse.  
Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de Etică al Tokyo University of Science, respectând ghidurile ARRIVE și NIH.

Rezultate

Confirmarea formării hidrogelului ADN Takumi

Analize PAGE:  

• S-a observat că, în prezența a 150 mM NaCl, ODN-urile 14s-(T-10c)2 sau 18s-(T-10c)2 formează structuri dimerice (unități Takumi).  
• Amestecul celor două unități complementare rămâne în zona puțului de încărcare (nu migrează în gel), ceea ce indică formarea unui hidrogel.  

Temperaturi de topire (Tm):  

• Hidrogelul prezintă adesea două praguri Tm: unul asociat cu dizolvarea legăturilor dintre unități (coezive) și altul cu dizolvarea tulpinii palindromice.  
• Pentru versiunea cu coezive GC de 10 nucleotide, Tm-ul care ține de coezive s-a situat peste 40 °C, iar cel al tulpinii, peste 58–60 °C.

Proprietăți reologice și stabilitatea hidrogelului

• Modul de stocare (G′) la 44 mg/mL de ADN a variat între 2540 și 4710 Pa (în funcție de designul unității Takumi).  
• Cele cu coezive mai scurte sau bogate în AT (ex.: 8 nucleotide sau 10 nucleotide AT) au avut o fermitate mai mică și un punct sol-gel mai scăzut, sub 37 °C, ceea ce face ca hidrogelul să nu fie stabil la temperatura corpului.  
• Hidrogelurile cu coezive de 10 nucleotide GC și cu tulpină de minim 12 nucleotide au prezentat valori ridicate ale G′ la 37 °C:  

• 12s-(T-10c)2 a atins un G′ de aproape 4060 Pa la 37 °C și o temperatură de tranziție sol-gel de circa 49,8 °C.  

• Vâscozitatea hidrogelurilor a scăzut cu creșterea ratei de forfecare, confirmând injectabilitatea prin ace subțiri (29G).

Retenția in vivo și siguranța la locul injectării

• Retenția subcutanată a fost monitorizată prin marcarea ADN-ului cu propidiu iodid:  

• Structurile Takumi mai instabile (cu 8 nucleotide coezive sau bogate în AT) au dispărut rapid din locul de injectare.  
• Varianta 18s-(T-10c)2 și, mai ales, 12s-(T-10c)2 au rămas detectabile până la 5–7 zile, având o timp de înjumătățire (t½) de până la 167 ore (la 12s-(T-10c)2).  
• Aproximativ 54,4% din ADN-ul injectat cu 12s-(T-10c)2 se regăsea încă în piele după 72 de ore.  

• Examen histologic: injectarea hidrogelurilor Takumi nu a indus inflamații marcate la nivelul pielii (spre deosebire de controlul cu adjuvant alum).

Utilizarea hidrogelului Takumi ca sistem de livrare a doxorubicinei

• Retenția subcutanată a DOX:  

• Doxorubicina liberă s-a eliminat rapid, în timp ce DOX încorporată în hidrogelul Takumi (ex. 12s-(T-10c)2) s-a menținut peste 168 ore la locul injectării, similar cu marcajul PI.  

• Efect antitumoral (model de șoareci cu tumoră de colon26):  

• Injectările intratumorale cu DOX/DNA hidrogel au întârziat semnificativ creșterea tumorală, mai mult decât doxorubicina simplă.  
• Șoarecii nu au prezentat diferențe notabile în greutate corporală, sugerând o tolerabilitate bună.

Concluzii

Studiul demonstrează că un hidrogel ADN format din două ODN-uri scurte, cu un design Takumi optimizat, poate oferi retentie prelungită in vivo și poate funcționa drept sistem de eliberare susținută pentru medicamente, precum doxorubicina. Principalele concluzii sunt:

• Lungimea minimă de 12 nucleotide în tulpină și 10 nucleotide GC în părțile coezive asigură o formare stabilă a hidrogelului și reținere prelungită în țesut.
• Costuri reduse și șanse mai mici de efecte nedorite față de hidrogelurile ADN care necesită numeroase oligonucleotide complexe.
• Posibilitate de încărcare și eliberare treptată a substanțelor bioactive (ex. DOX), demonstrând potențial terapeutic în oncologie și alte domenii.
• Siguranță: Absența unor reacții inflamatorii locale semnificative la șoareci și degradare naturală (biodegradabilitate) a hidrogelului în timp.

Acest nou design Takumi deschide calea spre utilizări clinice viitoare în livrarea personalizată a medicamentelor, imunoterapii și vaccinuri, oferind un balans optim între stabilitate, biocompatibilitate și costuri de producție.