Retronii în competiţie cu tehnica CRISPR

Recent a fost dezvoltat un instrument de editare genetică, Retron Library Recombineering (RLR) ce produce milioane de mutaţii simultan şi adaugă câte „un cod de bare” fiecărei celule bacteriene mutante astfel încât o întreagă populaţie de bacterii să fie investigată într-o singură etapă. Comparativ cu tehnica CRISPR, care are unele limite aceasta nu este toxică şi rata de editare este mai mare.

CRISPR-Cas 9 presupune căutarea şi „secţionarea” unor zone specifice din ADN, dar editarea propriu-zisă se referă la inserţia unor fragmente ADN în acele zone pentru a repara „breşa”. Aici, CRISPR mai trebuie ajustată, deoarece uneori acţionează şi în alte porţiuni de ADN decât cele ţintă. Tehnicile alternative fac acest „switch” fără să „taie” ADN-ul, introducând materialul genetic necesar editării în timpul diviziunilor celulare. Pentru a scuti efortul de citire a unui număr imens de mutaţii apărute, cercetătorii de la Harvard au dezvoltat tehnica RLR. Iniţial, despre retroni nu se ştia decât că ar fi fragmente de ADN bacterian cu rol în procesul de reverstranscriere şi formare de ADNmonocatenar (ssADN), dar în iunie 2020 s-a descoperit că acest ssADN are rol în imunitatea bacteriană, semnalând dacă bacteria este infectată cu un virus.

Procedurile de editare genică prin recombinare integrează mutaţia dorită în ADN-ul organismului de studiat cu ajutorul ADN monocatenar la a cărui producere contribuie retronii. Integrarea se face fie prin CRISPR, fie prin asocierea ssADN cu un fragment proteic numit SSAP (single stranded annealing protein) care în timpul diviziunii celulare îl ajută să se integreze în ADN-ul celulelor fiice. Daniel Goodman, unul din cercetătorii implicaţi în studiu spune că prin tehnica retronilor se evită alterarea ADN-ului nativ, fiind mai sigură decât CRISPR. Ca să ii testeze eficacitatea, ei au creat o serie de plasmide (ADN bacterian circular) cu gene de rezistenţă la antibiotice corelate cu retroni şi cu gene pentru SSAP şi le-au inserat în culturi de E. coli. Doar 0,1% din bacterii au încorporat mutaţia. Pentru a rezolva problema au inactivat mecanismul natural de reparare ce detecta mutaţiile şi genele bacteriene care codificau exonucleaze, enzime ce distrug ssADN suspect pentru bacterie.

Rezultatul a fost că peste 90% din populaţia de E. coli a integrat mutaţia. Un alt avantaj al tehnicii e că la secvenţiere nu mai e nevoie de analiza întreg genomului bacterian pentru a descoperi ce mutaţie a primit bacteria din experiment, ci doar a retronilor, aceştia funcţionând ca un fel de „shortcut”.

sursa: Science Daily
foto: Max Schubert / Wyss Institute at Harvard University