O nouă perspectivă asupra îmbătrânirii celulelor stem intestinale

Într-un studiu recent, condus de profesorul asociat Takuya Yamamoto și cercetătorul May Nakajima-Koyama, s-a investigat modul în care interferonul-γ (IFN-γ) și calea de semnalizare ERK/MAPK interacționează pentru a menține pe termen lung celulele stem intestinale. Lucrarea a fost realizată pe modele murine, comparând șoareci tineri (2-4 luni) cu șoareci în vârstă (22-27 luni), precum și șoareci foarte în vârstă (28-30 luni).
Epiteliul intestinal are cea mai rapidă rată de reînnoire celulară din organismul mamiferelor, datorită activității continue a celulelor stem intestinale (CSI), identificate prin expresia LGR5. Aceste celule se divid și generează celule transit-amplificatoare, care ulterior se diferențiază în enterocite (cu rol de absorbție) sau în tipuri secretoare (Paneth, caliciforme, tuft, enteroendocrine). Studiile anterioare au arătat că multiple căi de semnalizare extrinseci - provenite din nișa celulelor stem (celule Paneth, celule mezenchimale subepiteliale) și din celulele imune apropiate - reglează capacitatea de auto-renew și diferențiere a LGR5+ CSI.

Odată cu înaintarea în vârstă, apar modificări ale microambientului intestinal, precum disbioza microbiomului, activarea celulelor imune și alterarea permeabilității intestinale, ducând la inflamație sistemică. Chiar dacă studiile arată că CSI își pierd o parte din capacitatea regenerativă în condiții de stres sau leziune la vârstnici, surprinzător este faptul că în stare homeostatică, aceste celule continuă să susțină turnover-ul epitelial de-a lungul vieții. Această observație i-a condus pe autori la ipoteza că există un mecanism protector care, în ciuda mediului intestinal proinflamator la vârstnici, protejează și menține pool-ul de celule stem intestinale.

Datele studiului

Metodologie și tehnici utilizate

• Cercetătorii au comparat șoareci tineri (2-4 luni) cu șoareci în vârstă (22-27 luni) și șoareci „super-înaintați” (28-30 luni) pentru a evalua diferențele epiteliale și modificările funcționale apărute în criptele intestinale.
• Au analizat morfologia criptelor intestinale și au măsurat rata de turnover a epiteliului folosind marcaj cu EdU (etinil deoxiuridină).
• Au cuantificat și localizat celulele stem intestinale prin expresia Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 și prin expresia genei Olfm4, iar pentru celulele Paneth au folosit markerul CD24high.
• Pentru caracterizarea la nivel molecular, au efectuat:

• Secvențiere ARN în vrac (bulk RNA-seq) pe fracții celulare izolate (Lgr5GFPhigh - CSI, Lgr5GFPmedium/low - celule progenitoare, Lgr5GFPnegative/CD24high - celule Paneth).
• Single-cell RNA-seq (scRNA-seq) pe 10.844 celule din criptele intestinale, pentru a evidenția subpopulațiile celulare și schimbările specifice fiecărui tip de celulă.
Au validat modificările transcriptomice folosind analize in situ (imunohistochimie și hibridizare ARN in situ) și teste funcționale pe organoide intestinale cultivate ex vivo.

Date statistice și design experimental

• La analiza țesuturilor intestinale s-a observat o creștere de 115% a înălțimii criptelor în cazul șoarecilor în vârstă, comparativ cu cei tineri.
• Rata de regenerare tisulară (analizată prin EdU chase) scade semnificativ odată cu înaintarea în vârstă. În mod specific, zona de celule progenitoare (partea superioară a criptei) are mai puține celule EdU-pozitive la animalele în vârstă, în timp ce baza criptei (zona celulelor stem) nu prezintă modificări marcante în proliferare.
• Numărul CSI, definite prin Olfm4, rămâne relativ constant, însă distribuția subpopulațiilor de Lgr5GFP se modifică:

• crește proporția Lgr5GFPhigh/medium,
• scade proporția Lgr5GFPlow.

• Analizele bulk RNA-seq și scRNA-seq au evidențiat o upreglare a unor gene asociate cu procesele imune (procesarea și prezentarea antigenului - implicând gene MHC clasa II) și o subreglare a genelor implicate în ciclul celular.
• Markerii de îmbătrânire identificați și validați în epiteliul intestinal includ gene precum H2-Aa, H2-Ab1, Ceacam10 și Ly6e.

Experimente cu organoide intestinale

• În cultura de organoide, s-au testat modulatori ai semnalizării:

• IFN-γ (care activează calea dependentă de STAT1),
• inhibitori ai căii ERK/MAPK (iMEK),
• stimuli ai căilor TLR (poly(I:C), Pam3CSK4) și
• inhibitori ai p38/MAPK.

• S-a observat că IFN-γ (tip II) induce puternic H2-Aa și poate crește expresia Ly6e, în timp ce Ceacam10 crește la inhibarea căii ERK/MAPK.
• Dozele mari de IFN-γ singure pot afecta viabilitatea organoizilor (induc moarte celulară), iar inhibarea izolată a ERK/MAPK (prin iMEK) duce la creșterea numărului de CSI quiescente și la creșterea numărului de celule enteroendocrine. Combinația dintre IFN-γ și iMEK, însă, compensează efectele negative individuale, menținând un echilibru între starea activă și cea pasivă a celulelor stem.

Rezultate

• Îmbătrânirea afectează diferențierea CSI și reduce viteza de reînnoire a epiteliului intestinal, deși numărul CSI rămâne constant.
• Studii de trasare cu EdU și analiza expresiei Lgr5 au arătat că, deși proliferarea globală este încetinită, CSI continuă să susțină homeostazia.
• Analizele single-cell RNA-seq au evidențiat că modificările de îmbătrânire sunt:  

• specifice fiecărui tip de celulă,  
• enterocitele prezintă un profil de maturare sporit și suprareglare a genelor implicate în transportul lipidelor (ex. Fabp2, Apoa1, Apoc3, Apoa4),  
• celulele enteroendocrine sunt mai numeroase,  
• celulele caliciforme au unele gene specifice subreglate (ex. Clca1).

• Infiltrarea de celule T helper (CD4+) crește cu vârsta, iar celulele stem și progenitoare dobândesc MHC clasa II, sugerând o interacțiune imună crescută (prezentare antigenică către celulele T).
• Semnalizarea IFN-γ (crescută la vârstă) și inactivarea căii ERK/MAPK apar sincron, și împreună:  

• Mențin piscina de celule stem în ciuda mediului inflamator,  
• Contrabalansează efectele nocive atunci când fiecare cale este modificată în mod izolat.  

• Studiile pe organoide au arătat că:  

• IFN-γ menține un anumit grad de proliferare și capacitate de diferențiere spre enterocite,  
• iMEK sporește pasivitatea CSI și orientarea către linia enteroendocrină,  
• combinate, cele două semnalizări oferă un echilibru între starea activă (proliferativă) și cea pasivă.  

• S-a demonstrat implicarea factorului de transcripție Myc în reglarea rapidă a tranziției dintre starea activă și cea quiescentă a CSI. IFN-γ pare să stimuleze Myc, compensând parțial inhibarea Myc de către blocarea ERK/MAPK, prevenind astfel colapsul organoidelor și menținând homeostazia.

În concluzie, acest studiu evidențiază rolul crucial al echilibrului dintre IFN-γ și ERK/MAPK în menținerea pe termen lung a celulelor stem intestinale, chiar în condiții de îmbătrânire și mediu proinflamator. Deși modificările la nivelul epiteliului intestinal se fac simțite mai pronunțat în celulele diferențiate (enterocite, enteroendocrine, caliciforme), CSI reușesc să rămână relativ protejate datorită acestei sincronizări compensatorii a căilor de semnalizare. Studiul sugerează că intervențiile terapeutice care ar reechilibra aceste căi de semnalizare la nivelul mucoasei intestinale ar putea contribui la menținerea unui epiteliu funcțional și la reducerea inflamației și a disbiozei asociate vârstei.