Compuși naturali identificați ca inhibitori potențiali ai proteinei spike SARS-CoV-2

Studiul condus de profesorul asociat Md. Altaf-Ul-Amin, împreună cu Muhammad Alqaaf, Ahmad Kamal Nasution, Mohammad Bozlul Karim, Mahfujul Islam Rumman, Naoaki Ono și Shigehiko Kanaya de la Institutul de Știință și Tehnologie din Nara (NAIST), Japonia, precum și Muhammad Sedayuyanti Hendrick și Renderick Sedayuyanti Hendtman Universitatea din Indonezia analizează potențiale produse naturale (metaboliți secundari) cu rol de inhibitori ai proteinei Spike (S) a virusului SARS-CoV-2. Cercetările au fost realizate printr-o abordare bioinformatică și au fost publicate în contextul eforturilor globale de a dezvolta tratamente noi și eficiente împotriva bolii COVID-19.
În urma pandemiei COVID-19, diagnosticul și managementul bolii au evoluat semnificativ. Au fost dezvoltate metode de testare precum:

• Teste rapide antigen/anticorpi.
• Teste serologice imunoenzimatice.
• Teste RT-PCR.
• Investigații imagistice (radiografii, CT).

Concomitent, s-au implementat programe masive de vaccinare, iar cercetările s-au îndreptat și spre posibile terapii țintite. În acest sens, o direcție importantă o reprezintă interacțiunile moleculare între compuși activi și componenta S a virusului, care este esențială pentru fixarea la receptorul enzimei de conversie a angiotensinei 2 (ACE2) și pentru fuziunea cu membrana celulară.

Proteina S are mai multe regiuni-cheie:

• Domeniul S1, care include domeniul de legare a receptorului (RBD) și este esențial pentru atașarea virusului de celula-gazdă.
• Domeniul S2, care conține regiuni implicate în evenimentele de fuziune membranară și clivaj enzimatic.
• Regiuni specifice (S1/S2 și S2’) unde proteina S este tăiată de proteaze gazdă (ex. TMPRSS2).

Metaboliții secundari (SM) naturali, extrași din plante, ciuperci sau alte organisme, au atras atenția datorită diversității structurale și efectelor antivirale demonstrate la alți viruși. Compuși precum kaempferol, miricetina sau curcumina s-au dovedit promițători în legarea și inhibarea domeniului RBD al proteinei S. Totuși, probleme precum biodisponibilitatea și stabilitatea metabolică necesită investigații suplimentare.

Metodologie și analiză bioinformatică

Pentru a identifica posibile molecule naturale care să inhibe proteina S a SARS-CoV-2, autorii au urmat un flux de lucru complex, descris schematic (Fig. 2 în sursa originală). Principalele etape au fost:

Colectarea și selecția proteinelor S  

• Au fost căutate 1202 fișiere FASTA asociate cu proteine de tip SARS-CoV-2 din baza de date PDBJ.  
• Din aceste fișiere, s-au extras 204 proteine Spike relevante (S), restul fiind alte proteine structurale.

Analiza de tip clustering a proteinelor S  

• S-au efectuat 20.706 comparații pereche (alinierea pe perechi), iar după filtrare (score ≥ 50%), au rămas 9.536 interacțiuni semnificative.  
• Aplicând algoritmul DPClusSBO, aceste proteine au fost grupate în 5 clustere distincte (Clusterele 1, 2, 3, 4 și 5), fiecare caracterizat prin asemănări importante de secvență.

Identificarea moleculelor de legare (Binding Molecules – BMs) din BindingDB  

• S-au comparat cele 204 proteine S cu baza de date BindingDB (folosind BLASTp și un prag de identitate de 0,3), obținându-se 33.672 relații de tip proteină–moleculă.  
• Din aceste relații, au fost extrase 6.920 molecule unice potențial active, asociate cu 17 proteine S.

Identificarea metaboliților secundari (SM) din KNApSAcK  

• Cele 6920 molecule candidate au fost comparate cu 51.678 metaboliți secundari disponibili în KNApSAcK.  
• S-a folosit coeficientul Tanimoto (TC) cu prag de 0,85 pentru similaritatea dintre structură și amprenta moleculară a BMs.  
• Au rezultat 113 interacțiuni relevante BMs–SM.

Etapa de andocare moleculară

• SM-urile candidate au fost mapate pe clusterul corespunzător de proteine S.  
• S-au folosit programe specializate pentru pregătirea proteinelor (îndepărtarea apei, ionilor, micilor liganzi) și detectarea buzunarelor de legare (Fpocket).
• Pentru estimarea afinității de legare (binding energy, BE) s-a rulat SMINA, derivat de AutoDock Vina.

Analiza de biodisponibilitate și proprietăți medicamentoase  

SM-urile cu energii de legare negative au fost evaluate cu SwissADME pentru:

• Respectarea regulilor lui Lipinski (fără a depăși parametrii de masă moleculară, lipofilie etc.).
• Bioavailability Radar, care integrează parametri ca lipofilitatea, mărimea, polaritatea, solubilitatea, gradul de saturație și flexibilitatea.
• Scorul de biodisponibilitate (BAS), care poate fi 0,17, 0,55, 0,56 sau 0,85 (probabilitatea de a avea >10% absorbție orală).

Doar SM-urile care nu încalcă regula Lipinski, au parametrii în zona optimă din radar (zona roz) și au BAS mare au fost selectate pentru analiza finală.

Rezultate

Clusterele proteinelor Spike și identificarea SM-urilor

În urma analizei, au rezultat:

• 5 clustere distincte de proteine S (cu dimensiuni de 124, 62, 7, 5 și 3 secvențe).
• 69620 molecule testate inițial, redus la 6920 unice (potențiale BMs) și apoi la 113 interacțiuni cu SM din KNApSAcK.

Metaboliții s-au regăsit doar în Clusterele 1, 2 și 4, astfel:

• Cluster 1: 50 SM-uri potențiale.
• Cluster 2: 13 SM-uri potențiale.
• Cluster 4: 48 SM-uri potențiale.

Clusterele 3 și 5 nu au evidențiat SM-uri candidate.

Andocarea și evaluarea biofarmacologică a metaboliților secundari

Cluster 1:

• A cuprins două structuri de proteină S (PDB: 6ZP2 chainA și 7E7B chainA).  
• Din cele 50 SM-uri, după analiză Lipinski, radar de biodisponibilitate, energie de legare (BE) și BAS, au rămas 5 metaboliți secundari de top.
• Printre acestea se numără cefaelina (C000111307), emetina (C00001849), uzarigenina (C00032469), 9-O-Demetilcefaelina (C00051992) și linifolina A (C00003318).
• Acestea prezintă proprietăți variate, de la efecte anticancer și antivirale până la efecte antiparazitare și antiinflamatoare.

Cluster 2:

• Înglobează patru structuri S (PDB: 6ZFO chainA, 7NXA chainC, 6LZG chainB, 7E88 chainL).  
• Dintre cele 13 SM-uri, doar 4 au îndeplinit criteriile stricte.  
• Au fost selectate, în principal, cofeina (C00001492) și colchamina (C00027138), dar și citidina (C00042440) și teofilina (C00042238).
• Cofeina a prezentat un BE foarte bun (circa –10,189 kcal/mol) și scor de biodisponibilitate BAS 0,55, având totodată parametrii în zona optimă.
• Aceste molecule pot bloca RBD-ul proteinei S, împiedicând legarea virusului la receptorul ACE2.

Cluster 4:

• Reunește proteine S din PDB: 6M1V chainA, 6LXT chainA, 7C53 chainA.  
• Din 48 SM-uri, 2 au avut BAS=0,85 și alte 5 au ieșit în evidență la BAS=0,55.  
• Au fost alese 5 SM-uri: (+)-Epijasmonic acid (C00000446), (-)-Jasmonic acid (C00000218), 11-Hydroxyvittatine (C00002752), Staurosporina (C00018127) și Paxillina (C00023582).  
• Acestea pot interfera cu regiunea Heptad Repeat 1 (HR1) și cu locul S2/S2’, blocând fuziunea virală cu membrana gazdă.

Relevanța terapeutică a metaboliților naturali selectați

Autorii au investigat literatura științifică pentru fiecare metabolit, constatând posibile efecte:

• Antivirale: Unele molecule (ex. emetina) s-au dovedit eficiente și împotriva altor virusuri. În contextul SARS-CoV-2, pot inhiba inițierea fuziunii și fixarea la receptorul ACE2.
• Anticancer: Cefaelina, emetina, staurosporina etc. au mecanisme de inhibare a proliferării celulare și de inducere a apoptozei.
• Antiinflamatoare și imunomodulatoare: Linifolina A, cofeina, compușii jasmonici și altele pot reduce expresia citokinelor proinflamatoare.
• Neuroprotectoare: Cofeina și teofilina au roluri cunoscute în bolile neurodegenerative.
• Antifungice și reducerea toxicității (ex. paxillina) – relevanță în afecțiuni infecțioase și intoxicații.

Deși rezultatele sunt promițătoare, autorii subliniază că validarea acestora necesită studii experimentale in vitro și in vivo, pentru a confirma eficiența și siguranța clinică a respectivelor produse naturale.

Concluzii

Analiza computațională a identificat cinci clustere distincte de proteine SARS-CoV-2 S, cu potențiali metaboliți secundari (SM) capabili să se lege de domeniile critice implicate în atașarea și fuziunea virală. După andocare și analiza biofarmacologică (Lipinski, radar de biodisponibilitate, BAS), au fost reținute 14 metaboliți naturali cu date teoretice solide pentru a inhiba proteina Spike, incluzând compuși precum cefaelina, emetina, cofeina, staurosporina și paxillina. Datorită proprietăților lor multiple (antivirale, anticancer, antiinflamatoare, neuroprotectoare), acești metaboliți secundari pot oferi avantaje terapeutice suplimentare.

Studiul semnalează necesitatea confirmărilor experimentale suplimentare, care să integreze observațiile in silico cu experimente in vitro și in vivo. O astfel de abordare ar consolida baza științifică pentru dezvoltarea unor noi agenți antivirali împotriva COVID-19 și a altor coronavirusuri emergente. În plus, combinarea acestor compuși cu terapii deja consacrate sau cu antivirale sintetice ar putea crește eficacitatea și ar reduce rezistența virală, deschizând noi perspective în controlul infecțiilor cu SARS-CoV-2.