Oamenii de știință descoperă cum să reactiveze „comutatorul de ucidere” al cancerului

Studiul publicat în Nature Communications explorează o strategie inovatoare prin care un exon capcană (numit poison exon) din gena care codifică factorul de splicing TRA2β este menținut în ARN mesager cu ajutorul unor oligonucleotide antisens (ASO). TRA2β este un factor de îmbinare implicat în progresia tumorilor și se regăsește frecvent supraexprimat în diferite cancere, inclusiv de sân, plămân și alte tipuri. Autorii au urmărit să înțeleagă dacă blocarea excluderii acestui exon capcană și creșterea includerii sale în ARN poate reduce expresia proteinei TRA2β și poate produce efecte antitumorale.
Alternarea îmbinării (AS) este un mecanism prin care aceeași genă poate genera mai multe izoforme ARN, cu funcții diferite. În cancer, se observă adeseori modificări aberante de splicing ce contribuie la creșterea și supraviețuirea celulară. Proteina TRA2β, membră a familiei de factori de splicing SR, este suprareglată în multe forme de cancer, facilitând expresia unor izoforme care favorizează proliferarea tumorală și migrarea celulelor maligne. Nivelurile înalte ale proteinei TRA2β sunt asociate cu un prognostic mai prost și o rată de supraviețuire globală scăzută la pacienți.

Acest studiu pornește de la observația că pre-ARN-ul TRA2β include un „poison exon” (PE) care, prin introducerea unui codon stop prematur, direcționează transcrisul către dezintegrarea ARNm mediată de nonsens (NMD). În celulele tumorale, acest exon capcană este însă adesea sărit, ceea ce duce la niveluri crescute de proteină TRA2β și la fenotipuri agresive.

Despre studiu

Mecanismul și ipoteza de lucru

Autorii au proiectat oligonucleotide antisens antisens cu comutare de îmbinare (ASO) care blochează secvențe-silencer din intron, cu scopul de a crește includerea exonului capcană. Această abordare rezultă în:

• Scăderea sintezei proteinei TRA2β, deoarece transcrisele cu exonul inclus sunt degradate sau nu codifică proteina funcțională.
• Creșterea unui transcris lung necodificator (lncRNA) care conține exonul capcană - acest ARN poate acționa ca un „burete” pentru alți factori de legare ARN în nucleu, perturbând procesele de reglare a îmbinării și de procesare a ARN.

Date experimentale

1. Analiza în baza TCGA (The Cancer Genome Atlas): S-a constatat că nivelul scăzut de includere a exonului TRA2β-PE corelează cu supraviețuirea mai redusă a pacienților în mai multe tipuri de tumori (mamar, cervical, leucemie mieloidă acută, melanom etc.).

2. Testarea ASO în linii celulare: Oligonucleotidele antisens concepute (denumite ASO-1570 și variante apropiate) au fost testate in vitro pe multiple linii celulare de cancer (glioblastom, sân, vezică urinară, melanom, colon etc.). După transfectarea cu ASO-1570, s-au observat:

• Creșterea semnificativă a includerii exonului capcană
• Reducerea proteinei TRA2β
• Inhibarea proliferării celulare și creșterea apoptozei în mai multe dintre aceste linii

3. Analize de transcriptomică: Secvențierea ARN (RNA-seq) pe celule tratate cu ASO-1570 a relevat mii de evenimente de îmbinare afectate, multe în gene esențiale pentru reglarea ciclului celular, reparația ADN și căi semnificative în cancer (p53, mTOR etc.). Printre exemple se remarcă:

• MDM2, o genă care descompune proteina p53; skipping-ul indus de ASO-1570 duce la pierderea transcriselor funcționale MDM2 și la creșterea nivelurilor p53.
• RPS6KB1, o genă cheie în calea mTOR, ale cărei variante ARN cu exon lipsă produc scăderea fosforilării proteinei S6, implicată în sinteza proteică.

4. Analize complementare cu siARN și CRISPR: În loc să se inducă includerea exonului capcană, s-a încercat reducerea directă a proteinei TRA2β prin siARN și knockout CRISPR. Interesant, aceste metode nu au reprodus efectul pronunțat de citotoxicitate observat la utilizarea ASO-1570. Prin urmare, concluzia a fost că simpla reducere a proteinei TRA2β nu explică întreaga citotoxicitate, transcrisul cu exonul capcană (acționând ca lncRNA) având un rol esențial.

5. Interacțiunile transcrisului TRA2β-PE: Experimentele de pull-down ARN au identificat multiple proteine nucleare (DDX10, RBM15, NOLC1 etc.) care se leagă puternic de acest ARN conținând exonul capcană și sunt cunoscute pentru funcții în reglarea expresiei, îmbinării și stabilității ARN.

6. Modele tridimensionale (3D) și in vivo: Autorii au evidențiat că ASO-1570 inhibă creșterea neurosferelor de glioblastom și a organoidelor de cancer mamar. Într-un model murin de xenograft cu tumori derivare de la pacient (PDX) de cancer mamar triplu negativ, injecțiile intratumorale cu ASO-1570 au crescut semnificativ includerea exonului capcană și au încetinit ritmul de creștere tumorală, fără a provoca toxicitate sistemică majoră.

Rezultate

Studiul furnizează dovezi clare că:

• Blocarea excluderii TRA2β-PE cu ajutorul antisensului conduce la scăderea nivelurilor proteinei TRA2β și la producerea unui ARN lung necodificator (lncRNA) asociat cu perturbări funcționale majore în alte proteine-cheie nucleare.
• Citotoxicitatea indusă în celulele tumorale derivă dintr-un efect dublu: reducerea expresiei factorului oncogenic TRA2β și apariția unui ARN care se leagă și sechestrază proteine importante pentru supraviețuire.
• Eficiența acestui ASO-1570 a fost demonstrată in vitro, în culturi 2D și 3D, precum și in vivo, într-un model de xenograft de cancer mamar, evidențiind un potențial terapeutic interesant.

Concluzii

Această lucrare propune o abordare nouă și specifică pentru a reduce nivelurile proteinei oncogenice TRA2β în celulele de cancer prin includerea forțată a unui exon capcană, obținând astfel și un ARN necodificator cu proprietăți de „sugativă” pentru alte proteine nucleare. Spre deosebire de simpla reducere a proteinei prin siARN, strategia bazată pe oligonucléotide antisens nu doar scade TRA2β, ci și generează un transcris care perturbă căi esențiale de supraviețuire tumorală. Aceste rezultate sugerează că terapia prin modularea splicingului poate fi o direcție viabilă de tratament oncologic, deși sunt necesare optimizări suplimentare privind livrarea ASO către tumoră și stabilitatea chimică a oligonucleotidelor. În ansamblu, articolul demonstrează un potențial ridicat al țintirii exonilor capcană în factorii de splicing oncogenici, deschizând drumul pentru noi soluții terapeutice de tip splicing-switch (întrerupător de îmbinare).