Prelevarea de probe de aer detectează 70-90% din virusurile păsărilor de curte și dezvăluie încă 50 de amenințări ascunse

Piața de păsări vii reprezintă un punct critic pentru monitorizarea și detectarea timpurie a virusurilor zoonotice, deoarece interacțiunea intensă om-pasăre favorizează răspândirea patogenilor. Metodele tradiționale de prelevare a probelor de la păsări (tampon cloacal, tampon orofaringian) pot fi limitate prin faptul că doar o fracțiune dintre păsările infectate sunt detectate și, în plus, pot fi costisitoare și nesigure din punct de vedere al manipulării. În acest context, monitorizarea mediului, în special prin prelevarea de probe de aer, reprezintă o alternativă mai sigură și comprehensivă, facilitând totodată detectarea unor virusuri care pot fi trecute cu vederea de metoda clasică.
În acest studiu s-a comparat performanța metagenomicii bazate pe capturarea cu probe hibridizate (CVRP - comprehensive viral research panel) aplicată atât probărilor de mediu (aer, apă de spălare a carcaselor, apă de băut din cuști, tampoane de cușcă) cât și probărilor directe la păsări (tampon orofaringian/cloacal). Obiectivul major a fost să se evalueze dacă datele obținute prin metagenomică pe probe de mediu pot reprezenta cu precizie virusurile prezente în popularea de păsări domestice vândute în aceste piețe.

Metodologie și design de studiu

• Locații și perioadă: Probele au fost prelevate în 12 sesiuni de la două piețe de păsări vii din Cambodgia (Orussey, Phnom Penh și Daun Keo, Takeo) între ianuarie 2022 - aprilie 2023.
• Probele clasice (păsări): Tampon orofaringian și cloacal colectate de la rațe și găini domestice. Aceste tampoane au fost pool-ate în grupuri de 10, pe specii, separat cloacal/orofaringian.
• Probele de mediu:
  • Aer - folosit AerosolSense Sampler (Thermo Fisher) la 200 L/min timp de 3h, în 3 zone (zona de sacrificare, zona de depozit/păstrare a păsărilor și o zonă de control la distanță de piață).
  • Apă de spălare a carcaselor (carcass wash water) - 50 ml colectate din zona de sacrificare;
  • Tampoane de cușcă (cage swabs) - de la cuștile din zona de depozit;
  • Apă de băut (drinking water) - 2 ml din adăpători din cuștile cu păsări.
• Protocol de metagenomică:
  • ARN a fost extras de la fiecare probă, apoi s-a realizat sinteză cDNA și library prep cu kit-ul Twist Library Preparation EF;
  • S-a aplicat capturare țintită a virusurilor cu Twist Comprehensive Viral Research Panel (CVRP) pentru îmbunătățirea sensibilității;
  • Secvențiere pe platforma Illumina MiSeq (paired-end 75 bp), apoi procesare cu CZ ID pipeline (cloud-based). Evaluarea a implicat calcul de reads per million (RPM) și asamblare de contigs de novo.
• Analize de bioinformatică/statistică:
  • B-diversity (Jaccard) și PERMANOVA pentru a determina diferențe de compoziție virală între tipurile de probe;
  • Exerciții de „source-tracking” pentru a estima ponderea probelor de la păsări (specie/tip tampon) în compoziția virusurilor detectate în mediu;
  • Reconstrucții filogenetice maxim likelihood pentru confirmarea asemănărilor secvențelor virale între probele de la păsări și cele de mediu.

Rezultate principale

1. Probele de mediu surprind majoritatea virusurilor detectate în probele de păsări

• S-au detectat 84 de virusuri la nivelul probelor clasice de la păsări (cloacal/orofaringian), iar între 70%-90% dintre acestea au fost regăsite și în probele de mediu la fiecare sesiune de eșantionare.
• Virusurile respiratorii (de ex. gripă aviară, coronavirus avian) au fost frecvent regăsite și în aer, spălătura carcaselor și tampoanele de cușcă.
• Virusurile nedetectate în mediu se asociau în general cu abundență scăzută la păsări și/sau raritate în piață. De asemenea, majoritatea virusurilor nondetectate erau legate de patogeni oncovirali (ex. avian retrovirus) sau astrovirusuri cu circulație sporadică.

2. Mai multe tipuri de probe de mediu sunt complementare în captarea diversității virale

• Analiza diversității a indicat că probele de aer din zonele de sacrificare și stocare a păsărilor, precum și tampoanele de cușcă, conțin cele mai multe virusuri aviare (significativ mai mult decât aerul din afara pieței, apa de băut sau apa de spălare).
• Fiecare tip de probă de mediu a detectat un număr total mai mic de virusuri decât probele pool-ate direct de la păsări. Totuși, combinate, probele de mediu reușesc să reflecte un tablou complex și cuprinzător al virusurilor din piață.

3. Coexistența între probele de la păsări și cele de mediu

• În analiza asigurării mapării contig-urilor (≥200bp), majoritatea secvențelor virale obținute din tampoane clasice de la găini se regăseau în contig-urile de mediu. Performanța era mai bună pentru găini decât pentru rațe.
• Aer (sacrificare, ținere) și tampoane de cușcă mapau cea mai mare proporție de contig-uri de la găini. Pentru rațe, s-a observat mapare mai mică.

4. Detecția virusului gripal aviar (AIV) este mai frecventă în probele de mediu decât în swab-urile tradiționale

• S-au identificat 4 subtipuri de hemaglutinină (H5, H6, H7, H9) și 3 subtipuri de neuraminidază (N1, N2, N6). Versiunile H5 puternic patogene (clade 2.3.4.4b și 2.3.2.1c) au fost adesea surprinse exclusiv în probele de mediu.
• Aceeași tendință pentru subtipurile H9, H6 și genele interne PB2, PA - contig-urile de mediu au reflectat foarte bine cele din probele de la păsări și chiar au detectat prezența unor subtipuri lipsă în eșantionarea tradițională.

5. Filogenia altor virusuri aviare sugerează că secvențele din mediu sunt similare cu cele de la păsări

• Adenovirusuri aviare, coronavirusuri aviare, astrovirusuri aviare, retrovirusuri oncogene (ex. Rous sarcoma virus) - contig-urile provenite din mediu se situau filogenetic aproape de cele obținute din tampoane la păsări.
• Au fost detectate și virusuri adiționale neregasite prin probele tradiționale (ex. goose aviadenovirus A, pigeon circovirus etc.) și chiar câteva virusuri umane (ex. dengue 3, Rhinovirus A1), subliniind avantajul de a surprinde patogeni din surse multiple.

Implicații și concluzii

• Eficiență și acoperire largă: Metagenomica pe probe de mediu (în special aerul din zona sacrificării și stocării) a arătat o performanță ridicată în detectarea virusurilor aviare, deseori depășind metodele tradiționale (tampon la păsări). Acest lucru se explică prin faptul că virusurile shed-uite de păsări contaminau mediul și rămâneau detectabile.
• Domenii de îmbunătățire: Unele virusuri cu abundență scăzută și specifice la rațe nu au fost identificate în probele de mediu, indicând că detectarea poate eșua dacă prevalența e foarte mică și/sau shedding-ul scăzut. Combinația mai multor tipuri de probe de mediu + latența epidemiologică (mai mult timp de eșantionare) poate crește sensibilitatea.
• Avantaje practice: S-a demonstrat că sample-urile de mediu sunt mai sigure, mai rapide și mai puțin costisitoare, reducând riscurile biologice și problemele de bunăstare animală. În plus, s-a detectat o serie de patogeni care nu erau prinși la probele standard.
• Recomandări:
  • Proba de aer din zona de sacrificare și stocare plus swab-ul de cușcă pare esențială pentru captarea virusurilor de la găini;
  • Pentru rațe, datele sugerează că apa de spălare a carcaselor și tampon orofaringian ar putea fi mai indicative;
  • Monitorizarea constanță și complementară (de mediu + probe directe) asigură cea mai bună imagine de ansamblu și timp de reacție în cazul unei apariții subite a unui subtip viral patogen.

Concluzie generală: Metoda metagenomicii cu capturare țintită aplicată probelor de mediu în piețele de păsări vii poate detecta în mod fiabil virusurile aviare și cele emergente, complementând și, uneori, depășind abordarea tradițională de eșantionare a păsărilor. Implementarea acestei strategii poate duce la detectarea timpurie a patogenilor, reducerea costurilor și creșterea siguranței biologice, contribuind la prevenirea transmiterii zoonotice și a epidemiilor majore.