Picăturile pentru ochi au potențialul de a încetini progresia bolilor degenerative ale retinei

Retinopatiile degenerative (inclusiv retinitele pigmetare – RP – și degenerescența maculară legată de vârstă – AMD) duc la pierderea progresivă a fotoreceptorilor și la orbire ireversibilă. Datorită heterogenității genetice a bolilor retiniene, eforturile terapeutice care nu se limitează la o singură genă (abordări gene-independent), devin tot mai atractive. Acest studiu explorează un astfel de agent, peptidele derivate din proteina PEDF, focalizându-se în special pe varianta H105A, administrată ca picături oculare la șoareci cu RP și testată și pe organoizi retinieni derivați din celule stem umane.

Context

• Deteriorarea progresivă a fotoreceptorilor este mecanismul central al multor distrofii retiniene, în special retinita pigmentară (RP). Din cauza multitudinii de mutații implicate, terapiile standard, inclusiv injectările intravitroase, implanturile sau intervențiile genice, rămân fie invazive, fie specifice unei subpopulații genetice.
• PEDF (factor derivat din epiteliul pigmentar) este o proteină cu efecte neuroprotective ample, care pot apăra fotoreceptorii de apoptoză, independent de mutațiile genetice specifice. S-a demonstrat că regiunea de 17 aminoacizi („17-mer”) a PEDF este crucială pentru interacțiunea cu receptorul PEDF-R, stimulând căi ce reduc moartea celulară.
• Două fragmente scurte, 17-mer și o variantă sa, H105A, s-au dovedit neurotrofice și capabile să activeze PEDF-R. Alt fragment, R99A, lipsește de afinitate pentru receptor și de efect neuroprotector.

Modele experimentale și obiective

• Au fost investigate două modele murine RP cu cauze genetice distincte, ambele relevante pentru retinopatii umane:

• rd10, cu mutație în PDE6b (autosomal recesiv), caracterizat de degenerarea rapidă a fotoreceptorilor până la ~P30.
• RhoP23H/+, cu mutație Pro23His în rhodopsin (cea mai frecventă mutație AD), având o evoluție mai lentă.

• Un model adițional, rd10/Serpinf1^-/-, are degenerescență agravată datorită absenței PEDF, crescând susceptibilitatea retinei.
• În plus, s-au folosit organoizi retinieni derivati din celule stem iPSC umane (RO), supuși stresului oxidativ cu extract de fum de țigară (CSE), pentru a testa efectele pe fotoreceptori umani.

Obiectivul: să se evalueze dacă peptida H105A (și 17-mer) administrată topic (prin picături) penetrează retina, activează receptorul PEDF-R și protejează fotoreceptorii de moarte, îmbunătățind funcția vizuală. S-au investigat și alte moduri de livrare, inclusiv vectorul AAV2, pentru a evalua o potențială expresie pe termen lung.

Principalele rezultate

Pătrunderea peptidei și activarea PEDF-R

• Aplicare prin picături: Marcată cu fluorescent (Alexa488), 17-mer și H105A s-au detectat deja la 1 oră post-aplicare în fundul de ochi la șoareci C57BL/6J, scăzând treptat în intensitate până la dispariția la ~24–48h. Aproximativ 10% din cantitatea aplicată ajunge la retina posterioară.
• Specificitate: Distribuția în retina externă (segmentele interne și externe ale fotoreceptorilor) a fost mai pronunțată la H105A>17-mer, corelând cu afinitatea pentru receptorul PEDF-R. R99A, care nu leagă receptorul, pătrunde, dar mai difuz și fără efect neuroprotector.
• Activarea PEDF-R: Testele in vitro cu proteina recombinantă PEDF-R arată că doar 17-mer și H105A stimulează activitatea fosfolipazei A2. R99A nu are acest efect.

Prevenirea degenerescenței fotoreceptorilor în modelele RP murine (rd10 și rd10/Serpinf1^-/-)

• Marcarea in vivo a celulelor murinde: Folosind un colorant (PSVue-550) care detectează externalizarea fosfatidilserinei, s-a evidențiat moartea fotoreceptorilor la P21 în rd10. Picăturile cu 17-mer și H105A, administrate zilnic din P15, au redus semnificativ semnalul de moarte celulară, H105A fiind mai potent. R99A, inactiv, nu a arătat efect.
• Reglarea căii pro/anti-apoptotice: Aceleași tratamente reduc BAX și cresc BCL2 în retine, confirmând un efect anti-apoptotic.
• Menținerea structurii retinei și funcției:

• Histologia la P21 arată un strat nuclear extern (ONL) mai gros la șoarecii tratați, indicând păstrarea fotoreceptorilor. 17-mer și H105A susțin integritatea celulelor la ambele modele (rd10 și rd10/Serpinf1^-/-), cu H105A având efect superior.
• ERG relevă amplitudini de undă a- și b- crescute față de controale, semn că fotoreceptorii și circuitele retiniene interne sunt mai funcționale.

Protecția RhoP23H/+ cu H105A

• Picături oculare: În RhoP23H/+, degenerarea e mai lentă, astfel s-a aplicat H105A de la P14 la P19. S-a observat menținerea integrității fotoreceptorilor, scădere a BAX și creștere a BCL2. În plus, OS rod/con au aspect mai normal la P19.
• Livrare cu vector AAV2 (intravitreal – IVT) pentru expresie prelungită: O singură injecție AAV-H105A la P5 menține retinele la P180, cu scădere TUNEL, normalizare BAX/BCL2 și ameliorare a reacției microgliale. Testele ERG la 6 luni arată o îmbunătățire clară la scotopic b-wave, indicând eficacitate pe termen lung.

Validare pe organoizi retinieni umani (RO)

• S-a folosit un model de stress oxidativ cu extract de fum de țigară (CSE), tipic pentru a genera moarte celulară a fotoreceptorilor.
• H105A (dar nu R99A) reduce marcat celulele moarte (marcate cu Ethidium homodimer sau TUNEL) și semnalul fosfatidilserinei (PSVue-794). Astfel, demonstrează capacitatea de protecție a fotoreceptorilor umani in vitro.

Implicații și noutăți

• Abordare independent de genă: RP are numeroase mutații (>100 gene), dar calea finală implică cascade comune de moarte celulară. H105A (și 17-mer) acționează la un nivel convergent, reglând homeostazia Ca^2+ și implicându-se în calea BAX/BCL2.
• Administrare non-invazivă: Picăturile oculare cu peptide scurte se dovedesc suficient de penetrante până la fotoreceptori, îmbunătățind parametrii structurali și funcționali ai retinei. Aceasta constituie o alternativă atractivă la administrarea intravitroasă/subretinală (care e mai invazivă și riscantă).
• Terapia genică: Pe lângă soluția topică, s-a demonstrat și viabilitatea livrării genetice a H105A printr-un vector AAV2. Aceasta a conferit protecție retiniană pe termen lung (6 luni) la RhoP23H/+.
• Relevanță clinică: Studiul pe organoizii umani confirmă că H105A are efect neuroprotector robust și întărește posibilitatea unor viitoare aplicații clinice. Această peptidă ar putea fi testată într-un spectru larg de distrofii retiniene (nu doar RP).
• Limitări: Eficacitatea la om va depinde de bariera oculară, de stabilitatea peptidei, de formulări farmaceutice optime (nanoparticule, liposomi etc.). Mai sunt necesare studii de toxicitate și durată a efectului. Totodată, AAV2 a fost testat în mod intravitreal (mai sigur), dar subretinal e încă standard pentru gene therapy; echilibrul risc/beneficiu rămâne de stabilit.

Concluzii generale

Acest studiu demonstrează că peptidele scurte H105A și 17-mer, derivate din regiunea neurotropă a proteinei PEDF, pot fi administrate fie prin picături oculare, fie prin vector viral, pentru a proteja fotoreceptorii de moarte în mai multe modele murine de RP și pe organoizi retinieni umani stresați. H105A s-a dovedit în mod special potent, reducând markeri de apoptoză și menținând funcția retiniană (ERG). Rezultatele susțin fezabilitatea unei abordări non-gene specifice pentru prevenirea degenerescenței retiniene, oferind un potențial nou tratament pentru pacienți cu retinită pigmentară și alte boli retiniene degenerative.