„Eșafod” celular, esențial pentru primul implant cu succes de mioblaste pe mușchi sănătoși

Într-un studiu publicat recent, o echipă de cercetători de la Universitatea Metropolitană din Tokyo a investigat posibilitatea transplantării de mioblaste direct în țesut muscular intact, folosind componente din matricea extracelulară, cu scopul de a găsi o soluție la atrofia musculară legată de vârstă (sarcopenie). Această cercetare, realizată pe șoareci de laborator, aduce dovezi conform cărora un amestec de mioblaste cu Matrigel ar putea favoriza „înglobarea” acestor celule în fibre musculare intacte și ar putea contribui la creșterea masei musculare.
Sarcopenia, adică scăderea progresivă a masei și a forței musculare asociată înaintării în vârstă, este o problemă majoră la nivel global. Deși exercițiile de rezistență combinate cu o nutriție adecvată reprezintă în prezent cea mai folosită strategie pentru menținerea masei musculare, pacienții vârstnici ori cei imobilizați întâmpină dificultăți în a efectua antrenamente de intensitate ridicată, care să ducă la o creștere semnificativă a forței. În plus, în momentul de față nu există un medicament eficient pentru tratarea sarcopeniei, ceea ce motivează cercetătorii să găsească noi modalități de intervenție.

Transplantarea de celule musculare este privită de mult timp ca o cale de tratament cu potențial pentru atrofia musculară. În afecțiuni precum distrofia musculară Duchene, mioblastele (obținute din celule stem musculare - așa-numitele celule satelit) au fost deja folosite în diverse studii clinice și preclinice, cu obiectivul de a regenera fibrele musculare afectate. Totuși, până acum, majoritatea eforturilor s-au concentrat pe transplantarea celulelor în mușchi deja afectați, unde fibrele sunt distruse și regenerarea este în curs. În cazul sarcopeniei, fibrele musculare intacte dar atrofiate nu oferă un mediu favorabil pentru supraviețuirea și integrarea mioblastelor, în absența unei leziuni care să declanșeze procesele regeneratoare naturale.

Un alt obstacol important în terapia celulară musculară este scăderea capacității de încorporare în mușchi a mioblastelor care au fost deja cultivate în laborator și au pierdut „starea” de celule satelit. Deși este necesară expansiunea ex vivo (în afara organismului) pentru a obține un număr suficient de mare de celule, culturile prelungite transformă majoritatea celulelor satelit în mioblaste, cu o eficiență de transplantare mai scăzută. În plus, mioblastele necesită acoperirea plăcilor de cultură cu componente de matrice extracelulară (de exemplu, Matrigel) pentru a prolifera și a se diferenția corespunzător. Pornind de la această idee, autorii studiului de față au emis ipoteza că includerea mioblastelor în Matrigel în momentul injectării directe în mușchiul intact ar putea recrea micro-mediul necesar supraviețuirii și integrării acestor celule în fibrele musculare existente.

Despre studiul actual

Modelul animal și pregătirea celulelor

Cercetătorii au folosit șoareci adulți (C57BL/6, considerați „martor” - numiți și WT) pentru a primi transplanturi de mioblaste. Celulele donatoare proveneau de la șoareci modificați genetic care exprimă proteina fluorescentă verde (GFP), astfel încât orice celulă donatoare și fibrele nou formate puteau fi identificate cu ușurință la microscop.

Pentru a obține mioblastele:

• Au fost recoltate fibre musculare din mușchiul extensor digitorum longus al șoarecilor donatori.
• Fibrele au fost tratate cu soluții de colagenază și ulterior cu Accutase, pentru a separa celulele satelit (ce dau naștere la mioblaste).
• După izolare, celulele satelit au fost cultivate timp de 7-8 zile în mediu suplimentat cu ser fetal bovin, factori de creștere și o concentrație scăzută de oxigen, ceea ce a permis proliferarea lor în mioblaste.

Protocol de injectare

• Au fost pregătite suspensii cu 1,0 × 10⁵ celule sau 1,0 × 10⁶ celule într-un volum final de 50 µL, amestecate cu diferite concentrații de Matrigel (0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 5 mg/mL).
• Transplantarea a avut loc în mușchiul tibialis anterior al șoarecilor WT anesteziați.  
• În unele experimente de control, mușchii au fost pre-lezați cu cardiotoxină (o substanță care distruge temporar fibrele musculare) cu 24 de ore înainte de injectare, pentru a se compara eficiența încorporării mioblastelor în mușchiul lezat față de cel intact.
• S-a testat și influența diferitelor ace și seringi (material plastic versus sticlă, grosimi de la 23 G până la 29 G) asupra supraviețuirii celulelor injectate.

Analize histologice și moleculare

După 3 săptămâni (iar în unele cazuri, după 6 săptămâni) de la injectare, mușchii tibialis anterior au fost recoltați și:

• Congelați și secționați la criostat (8-10 µm grosime).
• Analizați microscopic pentru a evidenția fibrele cu GFP, tiparele de laminină (componentă de matrice extracelulară), distribuția colagenului (cu colorație Sirius Red) și alte markere (cum ar fi receptorii sinaptici - α-bungarotoxină - și markeri de vascularizație - CD31).
• S-a măsurat intensitatea fluorescentă GFP și nivelul de ARN mesager (mARN) pentru GFP, pentru a cuantifica masa de celule transplantate integrate în fibrele musculare.
• S-a evaluat și expresia unor factori inflamatori (precum factorul de necroză tumorală alfa - TNF-α), pentru a exclude reacțiile imune semnificative.

Evaluarea masei și forței musculare

• După anumite intervale, șoarecii au fost supuși unei testări in vivo a forței mușchiului tibialis anterior. Mai precis, tendonul mușchiului a fost conectat la un traductor de forță, iar nervul peronier comun a fost stimulat electric pentru a induce contracții cu frecvență înaltă.
• Greutatea mușchiului transplantat a fost comparată cu cea a mușchiului control (în care s-a injectat doar Matrigel, fără celule).

Rezultate

Necesitatea prezenței unei matrice extracelulare:  

• În mușchiul intact, mioblastele injectate fără Matrigel nu s-au integrat aproape deloc, fapt confirmat prin absența aproape totală a fibrelor musculare marcate cu GFP.  
• Cu Matrigel (0,5 mg/mL), s-a observat apariția unui număr considerabil de fibre musculare GFP pozitive, chiar și în mușchi care nu fuseseră lezați în prealabil.

Alegerea seringii și a acului de injectare:  

• Seringile din plastic s-au dovedit mai potrivite decât cele din sticlă, probabil pentru că sticla are încărcare electrostatică și reține mai multe celule pe pereții seringii.  
• Diametrul acului (23 G, 26 G sau 29 G) a avut o influență mai mică, însă rezultatele cele mai bune (ca raport între daunele tisulare și viabilitatea celulară) au fost observate cu ac de 26 G.

Concentrația mare de Matrigel vs. fibroză:  

• Creșterea concentrației de Matrigel (de la 0,5 mg/mL la 2,5 mg/mL sau 5,0 mg/mL) a îmbunătățit numărul de fibre musculare noi formate din mioblaste, dar a dus la apariția unei zone extinse de fibroză (depuneri de colagen).
• Analizele de colorație Sirius Red și markeri de laminină au confirmat că în zonele cu concentrații mari de Matrigel apărea un exces de colagen și structuri fibroase.

Creșterea numărului de celule transplantate și impactul asupra fibrei musculare și fibrozării:  

• Când numărul de celule injectate a fost crescut de zece ori (de la 1,0 × 10⁵ la 1,0 × 10⁶), chiar și în combinație cu Matrigel în concentrație mare (2,5 mg/mL), s-a observat:  
• O creștere masivă a numărului de fibre GFP (peste 1000).  
• O reduce a proporției de fibroză în raport cu aria ocupată de fibrele nou-formate, deși nu a dispărut complet.  

Creșterea masei musculare, dar nu și a forței totale:  

• Injectarea a 1,0 × 10⁶ mioblaste în amestec cu 2,5 mg/mL Matrigel a dus la o creștere cu 10% a masei mușchiului tibialis anterior față de mușchiul control.  
• Analizele au arătat formarea de plăci neuromusculare (α-bungarotoxină) și vascularizație (CD31) în noile fibre musculare marcate cu GFP, confirmând că există integrare funcțională.  
• Totuși, forța maximă de contracție a mușchiului nu a înregistrat îmbunătățiri semnificative, cercetătorii sugerând că este nevoie de maturarea suplimentară a fibrelor pentru obținerea unui beneficiu funcțional vizibil (de exemplu, prin antrenament fizic sau factori suplimentari de creștere).

Concluzionând, studiul demonstrează că simpla combinare a mioblastelor cultivate cu Matrigel permite integrarea acestora în mușchi intact la șoareci și o creștere semnificativă a masei musculare. Acest lucru contrazice ipoteza larg răspândită conform căreia mioblastele nu pot supraviețui dacă mușchiul nu este mai întâi lezat. O provocare rămâne reducerea fibrozei apărute la concentrații mari de Matrigel și creșterea gradului de maturare a fibrelor pentru a obține inclusiv îmbunătățiri ale forței musculare. Studiul deschide calea către noi direcții în medicina regenerativă, în special pentru tratarea atrofiei musculare asociate îmbătrânirii.