Descoperire critică pentru cancerul pancreatic

Cercetătorii de la Perelman School of Medicine de la Universitatea din Pennsylvania și de la Penn Medicine Abramson Cancer Center au investigat modul în care inhibarea multi-selectivă a formelor active (legate de GTP) ale proteinei RAS, atât mutante, cât și de tip sălbatic, influențează regresia tumorilor și răspunsurile complete la nivelul adenocarcinomului pancreatic ductal. Cercetarea acestora a fost publicată în jurnalul Cancer Discovery și a implicat atât modele preclinice subcutanate, cât și modele ortotopice și autohtone, cu scopul de a înțelege mai bine rolul celulelor T în eficacitatea noilor terapii anti-RAS.
Majoritatea tumorilor de adenocarcinom pancreatic ductal prezintă mutații activatoare la nivelul genei KRAS, ceea ce determină menținerea semnalizării RAS în forma sa activată (legată de GTP). Acest fapt are consecințe profunde asupra creșterii și supraviețuirii celulelor tumorale, dar și asupra microambientului tumoral, generând un mediu cu pronunțat caracter imunodepresiv. Din acest motiv, terapiile care se bazează pe stimularea răspunsului imun, inclusiv cele ce vizează celulele T, nu reușesc adesea să obțină beneficii solide la pacienții cu adenocarcinom pancreatic ductal.

Totuși, dezvoltarea inhibitorilor KRAS a oferit noi perspective în cancerul pulmonar nescuamos cu mutații KRASG12C, deși rezistența secundară apare în majoritatea cazurilor. Rezultate similare s-au observat și în cancerele pancreatice cu aceeași mutație, cu mecanisme de rezistență asociate. În acest context, inhibitorii multi-selectivi RAS(ON) (care blochează formele active de KRAS, NRAS și HRAS, indiferent de tipul specific de mutație) pot oferi un avantaj terapeutic, abordând concomitent mai multe variante de RAS. Molecula clinică daraxonrasib (RMC-6236) a evidențiat deja activitate la pacienți cu diverse mutații KRAS într-un studiu de fază I/Ib.

S-a demonstrat anterior, inclusiv prin studii pe modele de cancer de pancreas și plămân, că inhibiția specifică a mutației KRASG12D (cea mai frecventă la adenocarcinomul pancreatic ductal) poate nu doar să afecteze direct celulele tumorale, ci și să remodeleze microambientul imun într-un sens favorabil infiltrării limfocitelor T. Cu toate acestea, efectele unei inhibiții care țintește simultan formele mutante și de tip sălbatic ale proteinei RAS asupra compartimentului imun nu erau complet cunoscute. Studiul explorează tocmai această ipoteză, analizând rolul sistemului imun (în special al celulelor T) și potențiala sinergie cu terapii precum imunoterapia (anticorpi anti-PD-1, anti-CTLA-4, agoniști CD40) și chimioterapia standard (gemcitabină și nab-paclitaxel).

Despre studiu

În acest studiu s-au utilizat mai multe modele preclinice de adenocarcinom pancreatic ductal, atât subcutanate cât și ortotopice, provenite din linii derivate de la șoareci KPC/Y (care exprimă KRASG12D și o mutație la nivelul genei p53). Aceste linii prezintă niveluri diferite de infiltrare limfocitară, de la scăzută (infiltrare mică de celule T) la ridicată (infiltrare mare). Autorii au testat două molecule reprezentative pentru inhibarea multi-selectivă RAS(ON):

• RMC-7977, utilizat ca moleculă experimentală reprezentativă în studii preclinice.
• Daraxonrasib (RMC-6236), inhibitor aflat în investigații clinice (fază I/Ib).

Doze și scheme de tratament

• RMC-7977 s-a administrat oral la 25 mg/kg corp/zi, în general timp de 7-10 zile sau mai mult, în funcție de protocol.  
• Daraxonrasib s-a administrat și el în regimuri similare, pentru a se verifica dacă efectele observate se traduc și la inhibitorul aflat în studii clinice.  

Metode și analize

• Tumorile au fost evaluate in vivo prin măsurători de volum, iar țesutul tumoral a fost analizat prin metode de imunofluorescență, citometrie în flux și analize transcriptomice (ex. NanoString) pentru a evalua infiltrarea imună și nivelul de semnalizare MAPK (prin măsurători ale fosforilării ERK).  
• Pentru evaluarea rolului celulelor T, s-au folosit experimente de depleție a limfocitelor T (cu anticorpi care blochează simultan CD4 și CD8 sau doar CD8) și modele de șoareci Batf3-/- (care nu pot activa în mod adecvat celulele T prin celule dendritice convenționale).  
• Pentru testarea capacității de potențare a răspunsului imun, s-au folosit combinații de imunoterapie: anticorpi anti-PD-1, anti-CTLA-4 și agoniști ai receptorului CD40 (FCP). S-au investigat și combinații cu chimioterapia standard (gemcitabină și nab-paclitaxel).  
• S-au realizat teste in vitro pe limfocite T murine și umane (activate sau neactivate) pentru a aprecia dacă RMC-7977 inhibă direct funcția și proliferarea limfocitelor T la concentrații terapeutic relevante.

Rezultate

1. Inhibarea multi-selectivă RAS(ON) determină regresii tumorale corelate cu nivelul inițial de infiltrare limfocitară

• În modelul subcutanat cu infiltrare mică de celule T, după 7 zile de tratament cu RMC-7977 (25 mg/kg), toate tumorile tratate (8/8) au regresat, față de progresie în lotul martor (8/8). Cu tratament prelungit, nu s-au înregistrat totuși răspunsuri complete.  
• Într-un model cu nivel intermediar de celule T, 30-40% dintre tumori au prezentat răspuns complet.  
• Într-un model caracterizat printr-o infiltrare mare de limfocite T, 9 din 10 tumori (90%) au atins remisie completă după 7 zile de tratament.
• Analizele de imunofluorescență au arătat scăderea fosforilării ERK (pERK) și creșterea morții celulare (marker cleaved caspase-3) la celulele tumorale. S-a constatat și creșterea αSMA+ și a depozitelor de colagen, indicând remanierea stromală, fără diferențe majore între modele, în afară de gradul de infiltrare a celulelor T.

2. Remodelarea microambientului tumoral și efecte asupra celulelor imune

• Micșorarea subpopulațiilor de celule mieloide imunodepresive (MDSC) în urma tratamentului cu RMC-7977, comparativ cu lotul martor, indică faptul că inhibarea RAS activ în celulele tumorale reduce recrutarea activă a acestor celule imunodepresive.  
• Creșterea fracțiunii de macrofage (markeri F4/80, iNOS crescut), cu tendință către un fenotip proinflamator (tip M1).  
• Creșterea infiltrării celulelor T CD4+ și CD8+, cu scăderea celulelor T reglatoare (FoxP3+). Celulele T CD8+ au prezentat expresie crescută de granzyme B și fenotip de memorie (CD44+, CD62L+).  
• Interesant, la tumorile cu infiltrare inițial redusă de celule T, efectul de creștere a infiltrației T se menține pe termen mai scurt, fiind parțial explicat de lipsa unei populații T preexistente suficient de mari pentru a fi activată.  
• În ganglionii limfatici de drenaj, șoarecii cu tumori bogate în limfocite T au arătat creșteri evidente ale celulelor T, inclusiv CD8+ Ki-67+, și markeri de activare (TNF-alfa, T-bet). În cazul tumorilor cu infiltrare redusă, aceste efecte au fost mai puțin marcate.

3. Contribuția crucială a celulelor T la profunzimea și durabilitatea regresiei tumorale

• Depleția combinată de celule T CD4 și CD8 (sau doar CD8) a anulat remisiile complete în modelele de tumoră cu infiltrare mare de celule T. De pildă, în cazul unei linii cu infiltrare T mare, 5 din 7 tumori au răspuns complet la RMC-7977 în absența depleției, însă niciuna nu a ajuns la răspuns complet când celulele T au fost eliminate.  
• În tumorile cu infiltrare mică de celule T, depleția limfocitelor nu a influențat semnificativ eficacitatea RMC-7977, sugerând că efectul imun se manifestă mai ales în tumorile în care există deja un anumit nivel de infiltrare T.  
• Testele cu daraxonrasib (RMC-6236) au evidențiat aceleași tendințe, confirmând că și la inhibitorul aflat în studii clinice componenta dependentă de celulele T este esențială pentru a obține remisiile profunde și prelungite.

4. Combinația cu imunoterapia crește durabilitatea răspunsului, mai ales în tumorile cu infiltrare T mare

• Administrarea daraxonrasib a dus la exprimare crescută a moleculelor de prezentare antigenică (MHC-I, MHC-II) pe celulele tumorale, concomitent cu scăderea populației mieloide și creșterea expresiei punctelor de control imun (PD-1, TIGIT, CTLA-4).  
• Într-un model cu infiltrare T mare, combinarea daraxonrasib și anti-PD-1 a oferit răspunsuri mult mai durabile față de oricare dintre monoterapii; după 59 de zile de tratament, 4 din 10 șoareci nu mai prezentau tumoră detectabilă (răspuns complet durabil).  
• În modelele cu infiltrare T scăzută, combinația cu anti-PD-1 nu a adus beneficii comparabile, confirmând că prezența inițială a unui infiltrat T joacă un rol major în succesul imunoterapiei.

5. Beneficiu prin combinarea cu agoniști CD40 și anticorpi anti-CTLA-4/anti-PD-1

• Adăugarea unui agoniști CD40 (F), împreună cu anticorpi anti-CTLA-4 și anti-PD-1 (CP), la RMC-7977 a dus la intensificarea regresiilor tumorale atât în cazul tumorilor T high, cât și T low.  
• În tumorile cu infiltrare T scăzută, combinația RMC-7977 + FCP a condus la regresii în 100% cazuri în decurs de 25 de zile, față de 57% cazuri cu RMC-7977 în monoterapie.  
• În plus, combinația cu chimioterapia (gemcitabină și nab-paclitaxel) a fost testată și s-au observat rezultate aditive în special la modelele autohtone KPC/Y, în care RMC-7977 sau RMC-7977 + FCP pot genera regresii tumorale semnificative, cu un control mai îndelungat al bolii.

6. Efectul scăzut asupra funcției limfocitelor T la concentrații terapeutice

• Testele in vitro pe limfocite T murine și umane au arătat că dozele la care RMC-7977 blochează semnificativ semnalizarea ERK în celulele tumorale nu afectează în mare măsură viabilitatea și proliferarea limfocitelor T activate.  
• La concentrații peste 10 nM, se poate observa o ușoară reducere a expresiei CD25 și IFN-gamma, însă aceste concentrații sunt superioare celor necesare pentru a inhiba tumorile cu mutații KRAS.  
• Într-un experiment de vaccinare in vivo cu ovalbumină (un antigen-model), animalele tratate cu RMC-7977 au avut chiar o creștere a numărului de celule T specifice față de cele nevaccinate și netratate, subliniind că inhibarea RAS(ON) nu compromite răspunsul imun și poate chiar să îl potențeze prin reducerea imunosupresiei tumorale.

Concluzii

Studiul demonstrează că inhibarea multi-selectivă a formelor active de RAS (mutante sau de tip sălbatic) poate genera regresii tumorale profunde în adenocarcinomul pancreatic ductal, beneficiul fiind clar dependent de celulele T în tumorile cu nivel înalt de infiltrare imună. Prin remodelarea microambientului tumoral, reducerea populațiilor mieloide imunodepresive și creșterea infiltrării și activității limfocitelor T, aceste inhibitoare RAS(ON) pregătesc terenul pentru a obține răspunsuri mai bune la imunoterapie. În special, combinația cu agoniști CD40 și anticorpi care blochează punctele de control imun s-a dovedit superioară monoterapiei, ducând la un procent crescut de răspunsuri complete și la un control tumoral de durată. Rezultatele oferă un argument solid pentru testarea clinică a acestor combinații în adenocarcinomul pancreatic ductal, având în vedere că efectele adverse asupra țesuturilor normale și asupra activării limfocitelor T par să fie reduse la dozele terapeutice relevante.