Cercetătorii fac un pas spre crearea vaccinului împotriva Salmonella

Salmonella este un gen de bacterii Gram-negative care provoacă anual peste 95 de milioane de cazuri de salmoneloză la nivel global. Diverse tulpini circulă în medii variate (intestinul uman, mediul animal, surse de apă și alimente contaminate). În plus, peste 2.600 de serotipuri diferite pot provoca fie febra tifoidă, fie forme non-tifoidiene de boală (NTS). Deși infecțiile NTS au, de obicei, o evoluție autolimitată, anumite serotipuri (precum Typhimurium, Dublin și Choleraesuis) pot avansa spre forme invazive (iNTS), potențial letale.
Pentru a combate aceste infecții, cercetările recente au explorat vaccinurile pe bază de vezicule extracelulare de dimensiuni mici (sEV) provenite din macrofage. Macrofagele sunt celule esențiale ale imunității înnăscute, dar Salmonella poate profita de aceste celule pentru a se ascunde și a se replica. În același timp, macrofagele infectate emit vezicule extracelulare cu rol de „semnalizare” ce pot stimula atât răspunsul imunitar înnăscut, cât și pe cel adaptativ. Anterior, s-a demonstrat că vaccinarea cu sEV-uri derivate dintr-o infecție cu S. Typhimurium protejează complet șoarecii împotriva unor doze letale de infecție sistemică. Pentru a valida această strategie la un nivel mai apropiat de realitate, studiul cercetătorilor UF/IFAS, publicat în jurnalul Infection and Immunity, și-a propus să testeze eficacitatea acestor sEV-uri și pe tulpini de Salmonella izolate din apele uzate, reprezentative pentru populația umană dintr-o comunitate.

Metodologia studiului

Selecția tulpinilor din apele uzate

Cercetătorii au prelevat 79 de probe de ape uzate pozitive la Salmonella (identificare prin RT-qPCR vizând gena invA). Din acestea, au fost izolate 120 de tulpini NTS, iar secvențierea a permis identificarea serotipurilor: Diarizonae, Enteritidis, Typhimurium, dar și Braenderup, Javiana, Newport, Saintpaul etc. Două tulpini cu relevanță clinică sporită (și frecvent regăsite în comunitate) au fost selectate pentru testele ulterioare:

• S. Diarizonae (subspecie distinctă, asociată unor forme clinice mai severe)
• S. Enteritidis (foarte răspândită și cauza frecventă de salmoneloză la oameni)

Aceste tulpini au fost apoi comparate cu o tulpină de laborator standard (S. Typhimurium UK-1) pentru a evalua potențialul vaccinului bazat pe sEV-uri de a oferi protecție extinsă (heterologă).

Obținerea și caracterizarea sEV-urilor

1. Macrofage infectate cu S. Typhimurium  

• S-au folosit celule de macrofage RAW 264.7 infectate cu S. Typhimurium UK-1.  

2. Izolare sEV  

• După 24 și 48 de ore de infecție, s-a colectat mediul de cultură, s-a filtrat și s-a concentrat prin ultracentrifugare la 100.000 × g.  
• Rezultatul a fost un concentrat de sEV-uri cu dimensiune medie de aproximativ 136 nm și o concentrație de ~10^11 particule/mL.  
• Analiza proteomică a confirmat prezența markerilor caracteristici de vezicule extracelulare și proteine implicate în semnalizarea imunitară (ex. OmpA, OmpC, OmpD, FliC).  

Protocol de vaccinare la șoareci

• sEV-urile, obținute din infecția cu S. Typhimurium, au fost administrate intranazal la șoareci BALB/c, în trei doze.  
• Ca martor pozitiv, s-a folosit o tulpină atenuată (∆aroA) de S. Typhimurium, administrată oral.  
• Ca martor negativ, s-a administrat intranazal doar soluție tampon PBS.

Rezultate

Creșterea și invazia intracelulară a tulpinilor nou-izolate

Printr-un test de protecție cu gentamicină (gentamicin protection assay) s-a urmărit invadarea și supraviețuirea intracelulară a celor trei tulpini:  

• S. Typhimurium UK-1 (tulpină de laborator) a arătat cea mai mare rată de invazie în macrofage, cu un număr semnificativ mai ridicat de CFU intracelular la 2 și 24 de ore post-infecție.
• S. Enteritidis și S. Diarizonae, izolate din ape uzate, au avut eficiență de invazie mai scăzută, de ~50% față de tulpina de laborator.

Diferențele de invazie pot indica trăsături genetice/antigenice variate între tulpinile de mediu și cele de laborator.

Răspunsul imun indus de vaccinarea cu sEV-uri

• S-au măsurat titrurile de anticorpi IgG în ser și SIgA în fecale, îndreptate împotriva trei serotipuri: Typhimurium, Enteritidis, Diarizonae.
• IgG (seric)  

• Grupul vaccinat cu sEV-uri a prezentat niveluri semnificativ crescute de IgG anti-Enteritidis și anti-Diarizonae, comparativ cu șoarecii de control (PBS).  
• Comparativ cu vaccinul live atenuat (∆aroA), titrurile de IgG ale grupului sEV au fost ceva mai scăzute pentru Enteritidis și Typhimurium, dar nu și pentru Diarizonae.  

• SIgA (fecal)  

• sEV-urile au declanșat un răspuns evident de SIgA anti-Enteritidis și anti-Diarizonae, similar cu răspunsul anti-Typhimurium.  
• Grupul vaccinat cu tulpina ∆aroA a avut, de asemenea, răspunsuri crescute de SIgA față de toate cele trei serotipuri, iar PBS nu a indus nicio creștere semnificativă.

Proteomul tulpinilor și posibilele antigene cheie

• Prin analiză proteomică (Orbitrap Fusion MS) s-a evidențiat că există diferențe de expresie pentru unele proteine între S. Typhimurium UK-1 și tulpinile Diarizonae/Enteritidis:  

• S. Diarizonae a suprareglat anumiți factori de stres (ex. proteine tip OsmC), dar a avut expresie mai scăzută pentru anumite enzime catabolice.  
• S. Enteritidis a prezentat abundență crescută de proteine asociate cu particulele de fazi și cu transportul de acizi grași, dar scădere la nivelul flagelinei (FliC) și altor proteine implicate în răspunsul la stres oxidativ.  

• Antigene comune (ex. OmpA, OmpC, OmpD, TolB, FliC), deja detectate anterior în sEV-uri, au fost regăsite la toate cele trei serotipuri, dar cu variații de abundență. De pildă:  
• OmpA - mai abundent în S. Typhimurium și S. Enteritidis
• FliC - mai abundent în S. Typhimurium și S. Diarizonae

Prezența acestor proteine în sEV-uri și în toate serotipurile analizate poate fi un motiv pentru care anticorpii dezvoltați în urma vaccinării sEV recunosc și tulpini heterologe.

Importanța metodologiei de supraveghere prin ape uzate (WBE)

• Studiul demonstrează că Epidemiologia bazată pe ape uzate (Wastewater-Based Epidemiology - WBE) poate descoperi serotipuri circulante în populație, inclusiv cazurile subclinice (care nu ajung în spitale).  
• S-a constatat că serotipuri precum Enteritidis, Typhimurium, Braenderup, Javiana, Newport erau deja cunoscute și din supravegherea clinică precedentă, confirmând utilitatea WBE în „radiografierea” reală a comunității.  
• Integrarea WBE cu cercetarea privind vaccinarea pe bază de sEV oferă o abordare complexă pentru dezvoltarea unor vaccinuri mai aproape de scenariile reale de infecție.

Concluzii

Acest studiu pune în evidență potențialul vaccinării pe bază de sEV-uri derivate din macrofage infectate cu S. Typhimurium de a genera imunitate extinsă împotriva altor serotipuri Salmonella izolate din mediu, în special Enteritidis și Diarizonae.  

Elemente cheie evidențiate:

• Răspuns imun robust - sEV-urile induc SIgA și IgG împotriva mai multor serotipuri, demonstrând potențial pentru acoperire antigenică largă.
• Validare prin tulpini reale - utilizarea izolatelor din ape uzate oferă o imagine mai fidelă a situației epidemiologice și asigură o relevanță sporită a rezultatelor.
• Complementaritate WBE - datele de supraveghere din apele uzate pot fi integrate cu studiile de vaccinare, îmbunătățind timpul de reacție și țintirea intervențiilor de sănătate publică.

Pe viitor, vor fi necesare studii care să investigheze protecția in vivo mai aprofundată, inclusiv provocări cu doze letale de tulpini heterologe, pentru a stabili cu certitudine eficacitatea și aplicabilitatea la scară largă a vaccinurilor bazate pe sEV-uri împotriva salmonelozei ne-tifoide. Totodată, corelarea datelor obținute cu celelalte abordări de supraveghere (clinică și veterinară) va consolida relevanța acestei abordări în prevenirea bolilor infecțioase emergente.