Un nou studiu identifică rolul cheie al proteinelor în psoriazis

Cercetătorii de la Case Western Reserve University School of Medicine au analizat rolul subunității NF-κB c-Rel în inflamația indusă prin receptorul Toll-like 7 (TLR7) în psoriazis, fiind realizat de un grup de cercetători din Statele Unite și publicat recent într-un jurnal științific de specialitate. Autorii studiului și-au propus să identifice în detaliu modul în care c-Rel reglează expresia unor citokine inflamatorii și rolul acestuia în patogeneza psoriazisului.
psoriazisul este o boală inflamatorie cronică a pielii, caracterizată de hiperplazie epidermică și producție excesivă de citokine, asociate cu infiltrarea de celule imune în derm. În mecanismul patogenic, celulele dendritice (CD) au un rol central, deoarece pot secreta mediatori inflamatori și pot activa selectiv limfocitele T, formând sinapse imune cu acestea. Numeroase studii au arătat că abuzul sau activarea necontrolată a CD-urilor poate agrava sau declanșa în mod direct fenomenele psoriazice.

Familia NF-κB, care cuprinde subunități precum RelA (p65), RelB, c-Rel, p50/p105 (NF-κB1) și p52/p100 (NF-κB2), reprezintă un set de factori de transcripție esențiali în reglarea inflamației. c-Rel, în special, a fost asociat cu expresia unor citokine proinflamatorii importante, precum IL-23p19, IL-1β, IL-6 și IL-12p35, dar și cu activarea și diferențierea celulelor T. Studiile anterioare au demonstrat că:

• Deficiența de c-Rel în anumite modele murine protejează față de poliartrita reumatoidă și encefalomielita autoimună.
• Knockdown parțial de c-Rel prin siRNA poate ameliora forma psoriasiformă indusă de imiquimod (IMQ).
• Totuși, lipsa completă de c-Rel poate agrava alte afecțiuni (ex. diabet autoimun) din cauza rolurilor complexe și specifice contextului celular.

TLR7 este un receptor din endozom, care recunoaște în principal ARN monocatenar și este activ în special în celulele dendritice (în special cele plasmacitoide) și în limfocitele B. În psoriazis, stimularea TLR7 prin substanțe precum imiquimod (IMQ) poate induce hiperplazie keratinocitară și inflamație asemănătoare cu cea din plăcile psoriazice umane. Atât în clinică, cât și în modele murine, administrarea locală de IMQ poate agrava sau declanșa leziuni psoriazice. Cu toate acestea, până la acest studiu nu era clar care subunitate NF-κB joacă rolul-cheie în calea de semnalizare TLR7 și cum contribuie aceasta la patogeneza psoriazică.

Despre studiul actual

Obiective și ipoteză de lucru

Autorii au emis ipoteza că NF-κB c-Rel ar putea fi un regulator central al inflamației mediate de TLR7 în celulele dendritice și că această axă TLR7/c-Rel are o contribuție esențială la dezvoltarea și menținerea psoriazisului. Studiul a integrat analize de transcriptomică pe biopsii umane, experimente in vitro pe linii celulare dendritice și keratinocitare, precum și un model murin de psoriazis indus de IMQ pentru a demonstra rolul specific al subunității c-Rel.

Date de transcriptomică pe probe umane

• Cercetătorii au analizat 7 seturi de date de tip micromatrice (GEO) care comparau pielea sănătoasă, pielea neleziunii psoriazice și pielea cu leziuni psoriazice.
• În toate aceste seturi, nivelul de expresie al c-Rel a fost semnificativ crescut în leziunile psoriazice față de probele de control sau cele nelezionale.
• Tratamentul pacienților cu agenți biologici (brodalumab, ustekinumab, etanercept) a redus nivelul de expresie al c-Rel doar în cazul persoanelor care au răspuns eficient la terapie, sugerând că c-Rel poate fi corelat cu severitatea bolii.
• În schimb, expresia p65 (RelA) nu a suferit modificări importante în aceste comparații, indicând o specificitate sporită a c-Rel în psoriazis.

Modele celulare și animale

Linii celulare folosite: DC2.4 (linie dendritică), HaCaT (linie keratinocitară umană), J558L (linie pentru obținerea de supernatante cu GM-CSF). Autorii au folosit și celule dendritice derivate din măduvă osoasă (BMDC) obținute de la șoareci C57BL/6J sălbatici (WT) și c-Rel KO.

Tehnici de editare genetică CRISPR/Cas9

• S-a generat knock-out (KO) pentru c-Rel, p65, și p50 în liniile DC2.4 și HaCaT.
• S-a confirmat absența proteinelor vizate prin Western blot și s-a testat funcționalitatea celulelor în prezența sau absența stimulării TLR7 (prin imiquimod, CL307 și loxoribine).

Model murin de psoriazis indus de imiquimod (IMQ)

• Șoarecii (c-Rel KO și WT C57BL/6J) au fost depilați pe o suprafață dorsală și tratați topic cu 62,5 mg cremă Aldara (5% IMQ) timp de 5 zile consecutiv.
• Scorul clinic pentru eritem și descuamare s-a evaluat zilnic, pe o scală de la 0 la 4.
• La ziua 6, s-au sacrificat șoarecii pentru evaluări histologice (H&E) și moleculare (PCR cantitativ, Western blot), măsurându-se grosimea epidermică și expresia citokinelor (IL-1β, IL-17A, IL-17F).
• S-a evaluat și statusul inflamației sistemice prin variația în greutate și mărimea splinei.

Analize moleculare și imunologice

• qPCR în timp real pentru genele țintă (IL-1β, IL-6, ICAM1, TNFα, CXCL2, IP10, A20, IFNβ ș.a.) și validarea transcripțională a diferențelor dintre celule WT și KO.
• Western blot și imunoprecipitare (IP) pentru a studia dimerizarea și translocarea subunităților NF-κB (p65, p50, c-Rel), inclusiv ipoteza formării dimerilor activatori (p65/c-Rel) versus dimerilor represori (p50/p50).
• Teste de oligonucleotide pulldown cu secvențe promotore de IL-1β și IL-6 pentru a determina cine se leagă efectiv de ADN în starea stimulată TLR7.
• Cocultură BMDC – limfocite T naive: BMDC (WT sau c-Rel KO) stimulate sau nu cu IMQ, apoi cultivate cu limfocite T CD4+ naive WT, în condiții de polarizare Th17 sau Th0, pentru a evalua cât de mult contribuie citokinele derivate din DC la diferențierea Th17.

Rezultate

Expresia c-Rel este crescută în psoriazis și scade la tratamente biologice

Analiza transcriptomică a 7 seturi de date GEO a arătat că în leziunile psoriazice există o creștere marcată a c-Rel, în timp ce tratamentele cu brodalumab, ustekinumab și etanercept reduc semnificativ expresia c-Rel la respondenții care își ameliorează boala. În contrast, expresia p65 nu s-a modificat semnificativ.

Deficiența c-Rel protejează șoarecii de modelul psoriazic indus de TLR7 (imiquimod)

• Șoarecii c-Rel KO tratați topic cu IMQ au prezentat reducerea semnificativă a eritemului și descuamării începând cu ziua 4, comparativ cu WT.
• Histologic, grosimea epidermică (acantoza) a fost mai mică la c-Rel KO decât la WT după 5 zile de IMQ, deși mai mare decât la șoarecii netratați.
• Expresia genelor IL-1β, IL-17A și IL-17F a fost de asemenea scăzută în pielea șoarecilor c-Rel KO, indicând un răspuns inflamator local diminuat.
• Inflamația sistemică (pierderea în greutate, splenomegalie) a fost similară la c-Rel KO și WT, arătând că absența c-Rel a protejat selectiv împotriva inflamației cutanate, nu și împotriva celei sistemice.

c-Rel este esențial în producția de citokine inflamate la celulele dendritice stimulate cu TLR7

• În linii dendritice DC2.4 c-Rel KO, stimularea cu IMQ, CL307 sau loxoribine (agoniști TLR7 chimic diferiți) nu mai inducea semnificativ IL-1β și IL-6. Expresia acestora era scăzută de peste 10 ori (în special la 3 ore post-stimulare) față de celule WT.
• Pentoxifilina, un inhibitor farmacologic NF-κB, a blocat similar producția de IL-1β și IL-6.
• Stimularea cu agoniști ai altor TLR-uri endozomali, TLR9 (CpG) și TLR3 (poly(I:C)), nu a fost afectată de absența c-Rel. Astfel, c-Rel pare să fie un regulator specific pentru TLR7.

c-Rel și p65 formează un dimer esențial pentru expresia genelor inflamatorii, în timp ce p50 are efect inhibitor

• Knock-out pentru p65 a abolit expresia IL-1β și IL-6 indusă de TLR7, confirmând că și p65 este necesar în aceeași cale.
• Knock-out pentru p50 a crescut expresia IL-6 sub stimul TLR7, sugerând că dimerul p50/p50 este inhibitor, iar lipsa lui p50 poate crește inflamația.
• În celulele c-Rel KO, s-a observat o translocare nucleară prelungită a p50 și legarea acestuia la promotorii IL-1β și IL-6 sub formă de homodimer inhibitor (p50/p50), blocând eficient accesul altor subunități la ADN și reprimând transcrierea.

BMDC c-Rel KO reproduc aceleași fenomene și sunt mai puțin capabile să inducă diferențierea Th17

• BMDC derivate de la șoareci WT și c-Rel KO au confirmat aceleași rezultate: IL-1β și IL-6 au scăzut drastic la c-Rel KO în urma stimulării cu IMQ.
• În cocultură cu limfocite T naive WT, BMDC c-Rel KO stimulate cu IMQ au indus mult mai puțini limfocite Th17, atât în condiții clasice de polarizare Th17, cât și în condiții Th0. Astfel, c-Rel din DC mediază producția de citokine esențiale (IL-1β, IL-6) pentru diferențierea Th17.
• Nici expresia moleculelor de costimulare CD80 sau CD86 nu a fost perturbată, sugerând că c-Rel acționează strict la nivel transcripțional asupra citokinelor, fără a altera maturarea globală a DC.

Concluzii

Studiul demonstrează că subunitatea NF-κB c-Rel este un factor critic în reglarea inflamației mediate de TLR7 în celulele dendritice și joacă un rol major în dezvoltarea și severitatea psoriazisului. Mecanismul cheie constă în formarea dimerului activator p65/c-Rel după stimularea TLR7 și, în absența c-Rel, homodimerul p50/p50 devine prevalent și blochează transcrierea genelor inflamatorii. Prin aceasta, DC-urile c-Rel KO nu mai pot furniza concentrațiile necesare de IL-1β și IL-6, de care T helper 17 (Th17) depind pentru diferențiere, fapt ce duce la un fenotip psoriasic redus la animale. Datele din seturile umane relevă că c-Rel este crescut în leziuni psoriazice și poate fi țintă pentru medicații viitoare, mai ales că există deja dovezi că inhibarea selectivă a c-Rel reduce inflamația fără a suprima global calea NF-κB.

Astfel, strategiile terapeutice de inhibare selectivă a c-Rel (prin molecule mici sau alte metode de blocare a factorilor de transcripție) ar putea fi o abordare promițătoare pentru tratamentul psoriazisului, având potențialul de a reduce inflamația locală fără a produce efecte adverse majore asociate blocării NF-κB în întregul organism.