Un nou studiu dezvăluie potențialul curativ al editării genomului pentru surditatea genetică

Surditatea congenitală este cea mai frecventă deficiență senzorială la nou-născuți. Aproape jumătate din cazurile de hipoacuzie severă au cauze genetice, iar cea mai comună genă implicată este GJB2, care codifică proteina conexină 26 (CX26). Aceasta asigură formarea joncțiunilor gap (gap junctions) din cohlee și este esențială pentru recircularea ionilor (în special K⁺) și menținerea homeostaziei în urechea internă.  

• Mutațiile recesive în GJB2 se pot aborda prin adăugarea unei versiuni normale a genei (terapia de înlocuire a genelor).  
• Mutațiile dominant-negative (cum este GJB2 R75W) însă blochează și funcția proteinei normale – necesitând o intervenție care corectează direct mutația patogenă în ADN.

Lucrarea publicată în JCI Insight propune o terapie de editare genomică prin intermediul adenovirusurilor adeno-asociate (AAV) pentru a corecta baza mutată în GJB2 (R75W) și a restabili structurile gap junction afectate. Autorii și-au concentrat eforturile pe o variantă compactă de base editor (ABE, adenine base editor) și pe vectorul AAV capabil să livreze întreg complexul în cohlee.

Mutația GJB2 R75W și deficitul său dominant-negative

Mutația R75W apare la nivel de un singur nucleotid (C→T) și împiedică formarea normală a gap junctions, duce la joncțiuni mici și fragmentate. Această mutație este dominantă negativ, adică proteina mutantă blochează și funcția alelei normale a GJB2, cauzând surditate și, în unele cazuri, palmoplantar keratoderma.

Tehnologia de editare bazată pe CRISPR/Cas și ABE

Spre deosebire de metodele convenționale de CRISPR/Cas9 care pot genera deleții/insertii, base editorii (abe) convertesc direct o bază în alta (A→G sau C→T) fără a produce rupturi majore în ADN. Autorii au folosit SaCas9 (din Staphylococcus aureus) pentru a crea o versiune mai compactă de ABE8e, deoarece varianta standard SpCas9 este prea mare pentru a fi inserată într-un unic vector AAV (< ~5 kb). S-au testat mai multe variante de ABEs și secvențe ARN-ghid, până s-a obținut o combinație cu eficiență semnificativă de T→C la poziția R75W, restaurând aminoacidul normal (Arg75).

Validarea in vitro

Folosind linii de celule HeLa cu expresie stabilă a proteinei CX26 R75W, autorii au arătat că versiunea finală (SaABE_V106W#1) a reușit să convertească eficient baza mutantă și să refacă morfologia normală a joncțiunilor gap. Analizele de imagine au evidențiat transformarea agregatelor mici și dispersate de CX26 mutant în structuri hexagonale/pentagonale caracteristice, iar permeabilitatea la molecule (test Neurobiotin) a fost restabilită, confirmând funcția fiziologică a gap junctions.

Livrarea printr-un vector AAV unic

• Autorii au integrat toate elementele necesare (Cas9 nicază, deaminaza TadA8e, secvența ARN-ghid, promotori etc.) într-un singur vector AAV („all-in-one AAV” – ~5.13 kb).  
• Deși dimensiunea depășește pragul optim (~4.7 kb), virusul AAV obținut a putut fi totuși produs și a arătat eficiență bună în a infesta celule HeLa și a corecta R75W.  
• Amplicon-seq a confirmat o rată de editare de ~46,8% la poziția țintă. Deși au existat și mutații „bystander” (pe bazele din proximitatea R75W), majoritatea nu au deteriorat structura proteinei CX26.

Experimente pe modelul murin cu mutație GJB2 R75W

• La șoarecii transgenici CX26^R75W (care prezintă hipoacuzie severă și fragmentări ale joncțiunilor gap în celulele din cohlee), autorii au testat administrarea vectorului AAV.  
• Ex vivo pe culturi organotipice de cohlee (nou-născuți, P0): gap junctions și morfologia normală a conexinelor au fost restaurate după infecția cu vectorul AAV.  
• In vivo la șoareci adulți (injectând vectorul în perilimfa urechii interne): examinarea histologică a arătat că joncțiunile gap au devenit mai lungi și mai organizate în cohlee, fără aspectul fragmentat.

Concluzii și semnificații

O nouă abordare terapeutică pentru mutațiile dominante GJB2

• Deoarece terapia de înlocuire a genelor nu poate inversa efectul dominant negativ, editarea genomică directă a mutației este soluția potențială.  
• Rezultatele indică faptul că AAV-mediated base editing la șoareci reface structurile gap junction implicate în recircularea K⁺ și, prin extindere, poate corecta aspectele histologice asociate hipoacuziei.

Tehnologie AAV „all-in-one”

• Autorii au creat un singur vector AAV care conține SaCas9 nicază, un editor TadA8e îmbunătățit (cu mutație V106W) și ARN-ul ghid. Astfel se simplifică administrarea și se potențează aplicabilitatea clinică.  
• Sistemul este relativ mic, fapt crucial pentru a se încadra în limitele de ambalare AAV, dar suficient de robust pentru a realiza editarea țintită.

Perspective pentru terapia genică în hipoacuzie ereditară

• AAV-ul folosit (AAV-Sia6e) are tropism bun pentru celulele suport din cohlee (Deiters, Hensen, fibroblaste etc.), vizate în mod natural de mutațiile GJB2.  
• Strategia demonstrează fezabilitatea și eficiența editării unei singure nucleotide mutante, cu potențial de a fi extrapolată la alte gene mai lungi ori la alte mutații punctiforme ce provoacă surditate.  
• Sunt necesare studii suplimentare pentru restabilirea auzului (măsurări funcționale), validări pe modele mai extinse, evaluări de siguranță a efectelor off-target și testări pe celule stem umane cu mutația R75W.

În concluzie, acest studiu demonstrează că editarea genomică bazată pe AAV și adenine base editor poate restaura structura și funcția joncțiunilor gap într-un model murin de hipoacuzie determinată de mutația dominant-negativă GJB2 R75W, marcând un pas important către dezvoltarea unor terapii genetice eficiente pentru cea mai frecventă cauză monogenică de surditate.