CRISPR - editarea genomului uman

Editarea genomică a numeroase varietăți celulare și organisme dispune de o nouă cale de abordare: sistemul CRISPR-Cas9 care este îndreptat către secvența ADN utilizând secvențe ARN specific programate (1, 2).

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) și proteina asociată Cas9 (CRISPR-associated nuclease 9) deține capacitatea de a manipula într-o manieră precisă genomul oricărui organism (1). Acest sistem prezintă un răspuns imun adaptativ care memorează reacția la infecțiile survenite în antecedente și integrează secvențe scurte, numite spacers, în locusul CRISPR. Aceste secvențe scurte intercalate cu repetiții sunt exprimate drept CRISPR ARN (crRNAs) care, în cadrul unei reinfecții, prin legare de proteinele Cas țintesc specific secvența interesată (2).

Ingineria genomică face referire la procesele prin intermediul cărora sunt realizate modificări precise ale genomului. Aplicabilitatea în domeniul medical prezintă un deosebit interes în ceea ce privește chirurgia genică (corecția in vivo a defectelor genetice sau epigenetice) (3).

Tehnici de inginerie genomică

CRISPR-Cas9, ZFN (zinc finger nucleases) și TALEN (transcriptional activator-like effector nucleases) prezintă același principiu de funcționare: o nuclează este îndreptată către o secvență genomică specifică pentru a cauza o ruptură dublă la nivelul ADN-ului (double strand DNA break-DBS). În această etapă, genomul se modifică prin mecanismul intrinsec de reparare, care poate fi realizat prin joncțiuni neomologate (nonhomologous end joining-NHEJ) sau omologate directe (homology-directed repair-HDR) (1).

Mecanismul de reparare NHEJ ligaturează cele două capete ale rupturii, însă în cadrul acestui proces pot avea loc inserții și/sau deleții ale unor perechi de baze. Mecanismul HRD utilizează secvența omoloagă drept șablon pentru repararea ADN-ului. Pe această ultimă cale pot fi introduse mutații specifice sau secvențe exogene (etichete codificate genetic), care furnizează celulei un șablon ADN omolog cu secvența de la nivelul rupturii. Cu toate acestea, celula poate folosi în procesul de reparare un alt șablon ADN intrinsec, celula deținând controlul asupra întregului proces de reparare (1).

Metoda de editare genomică CRISPR-Cas9 prezintă drept rădăcină mecanismul de apărare al celulei procariote coordonat prin intermediul unor secvențe ARN.

Secvențele scurte denumite protospacers provenite din genomul microorganismului străin sunt copiate între secvențele repetitive în locusul CRISPR al genomului gazdei. La acest nivel sunt transcrise și procesate secvențe scurte de ARN (crRNA) care orientează proteina Cas către secvența țintă. Există cel puțin 11 tipuri de sistem CRISPR-Cas care au fost grupate în trei categorii: I, II, III (1). Sistemul CRISPR-Cas categoria II, pare să dețină un rol reglator semnificativ în ceea ce privește patogenitatea bacteriană (2).

Aplicabilitatea CRISPR-Cas9

Capacitatea de reparare a defectelor ADN a fost demonstrată în cadrul șoarecilor de laborator (4) și similar acestui studiu a fost confirmată realizarea modificărilor similare și în cadrul embrionului uman (5). CRISPR-Cas9 deține potențial de aplicabilitate în terapia genică, tratamentul bolilor infecțioase, precum infecția cu virusul imunodeficienței umane (HIV) și ingineria materialului autolog al unui pacient în vederea terapiei cancerului sau altor afecțiuni (6).

Proteina Cas9 prezintă un potențial major în vederea procesului de corectare a unor mutații genice (loss of function mutations) care determină apariția afecțiunilor monogenice recesive, precum fibroza chistică, anemia falciformă, distrofia musculară Duchenne (3).

Anemia falciformă a fost prima afecțiune descrisă ca având substrat genetic și poate fi considerată prima afecțiune a cărei conduită terapeutică poate fi abordată prin intermediul metodei de editare a genomului. Acest aspect este vizat din pricina dificultăților terapeutice cu care se confruntă pacienții pediatrici suferinzi de această afecțiune. În prezent, anemia falciformă implică spitalizări numeroase și terapie medicamentoasă constantă, tratamentul curativ constând în transplant medular. CRISPR deține potențialul de a altera codul genetic al celulei stem într-o manieră care să determine celula eritropoietică să își urmeze cursul fiziologic (7).

Alte afecțiuni monogenice corespund prezenței unor mutații rezultate în urma duplicării secvențelor genomice. În aceste situații, se încearcă exploatarea proteinei Cas9 în sensul deleției elementelor duplicate. Ataxia Friedrich poate prezenta o rată de succes înaltă în privința aplicabilității metodei CRISPR-Cas9 deoarece prezintă duplicații în regiunile non-codante ale genei incriminate (3).

Efectul antimicrobian direct al sistemului CRISPR-Cas a fost recent studiat. Au fost create modele CRISPR artificiale menite să distrugă microorganismele patogene, urmărind în acest scop rezistența la antibioterapie și virulența genică. Această cale permite în cadrul unei populații bacteriene suprapopularea tulpinilor non-patogenice care vor acapara și îndepărta tulpinile patogenice. Un alt studiu a introdus o matrice CRISPR-Cas în cadrul bacteriei Escherichia Coli, destinată să sensibilizeze și să distrugă microorganismele care au dobândit rezistență la antibiotice, prin intermediul bacteriofagiilor litici (2).

Editarea genomică și-a dovedit eficiența în orizonturi de cercetare mai largi, fiind utilizată cu scopul încercării de a dezvolta abordări terapeutice antivirale. În urma unui studiu realizat în 2014, a fost observată eradicarea genomului virusului imunodeficienției umane - HIV din cadrul celulelor cu infecție latentă (8). Alte studii au obiectivat prevenția infecției prin alterarea proteinei de suprafață specifice ccr5, care reprezintă un co-receptor al HIV pentru a pătrunde în celula gazdă (2).

Odată recunoscut potențialul metodei CRISPR-Cas9 de editare genomică în diverse abordări terapeutice, cercetarea în acest domeniu continuă (2).